污水处理厂空气介质抗生素抗性基因的分布

高新磊，邵明非，贺小萌，欧阳峰，商丹丹，李继,*

1． 哈尔滨工业大学深圳研究生院 深圳市水资源利用与环境污染控制重点实验室，深圳 518055 2． 北京国环清华环境工程设计研究院有限公司深圳分院，深圳 518049

污水处理厂空气介质抗生素抗性基因的分布

高新磊1，邵明非1，贺小萌1，欧阳峰1，商丹丹2，李继1,*

1． 哈尔滨工业大学深圳研究生院 深圳市水资源利用与环境污染控制重点实验室，深圳 518055 2． 北京国环清华环境工程设计研究院有限公司深圳分院，深圳 518049

考察了污水处理厂空气介质中典型的抗性基因(antibiotic resistance genes, ARGs)污染水平和浓度分布，并通过16S rRNA高通量技术对样品进行亲缘性及溯源研究。结果表明，在污水厂空气样品中8种抗生素抗性基因的检出率均超过50%，其中tetC、sul1、sul2和ermB检出率为100%。在曝气池和污泥脱水车间空气样品中8种抗性基因检出率均为100%。对其中的sul1、sul2、tetG和tetX共4种ARGs的定量分析结果表明，以上4种基因的相对浓度范围在102～105copies·ng-1DNA之间，与邻近居民区空气样品抗性基因浓度处于同一水平；空气样品16S rRNA高通量测序聚类分析结果显示，居民区空气与污水厂园区内空气有较高的种群相似度，污水厂处理单元对其邻近区域的空气介质微生物组成影响较大。

抗生素抗性基因；空气介质微生物；污水厂

城市市政污水厂是抗生素抗性细菌(antibiotic resistance bacteria, ARB)和抗性基因(antibiotic resistance genes, ARGs)高度富集和增殖的场所，四环素类、大环内酯类和磺胺类抗性基因是其中重要的组成部分[1-2]。近年来有关污水处理系统中高检出率和高浓度的抗性基因的报道已引起了社会的广泛关注[3-6]。国内外关于污水厂环境中抗生素抗性基因的研究主要集中于水相和污泥相，而对空气介质中存在的ARGs则关注较少[7]。污水厂处理工艺中的充氧曝气以及污泥干燥等过程可将污水处理系统储存库中的高浓度ARGs转移至空气中并可能对处理厂及周边环境造成直接影响。Chapin等[8]研究发现，养猪场室内空气中分离的革兰氏阳性菌菌种中至少98%具双重耐药性。Gilbert等[9]发现医院空气中微生物气溶胶的DNA提取物含有tetG、ermF和ermX基因。目前报道的空气中抗生素抗性基因已有16种之多[10]。动物养殖场和医疗诊所可能是空气中几类四环素抗性基因的源头，并可通过空气交换和传播[11]。有研究采用高通量测序方法获得了北京雾霾天PM2.5中微生物的组成，并发现其中存在少量源于土壤的可能致病或致过敏微生物的DNA序列，为空气微生物组成和溯源研究提供了重要的方法依据[12]。

污水厂空气中的抗性基因污染对人的影响较为隐秘因而长期被人们所忽视。本文针对几种典型的ARGs对污水厂空气样品中抗性基因的污染水平、浓度分布开展研究，并通过使用高通量技术对样品进行亲缘性及溯源研究[13-14]。

1 材料与方法 (Materials and methods)

1.1 样品采集

选用深圳市罗湖区罗芳污水处理厂作为研究对象，该厂采用AB法工艺处理污水，分别取进水、格栅、厌氧、缺氧、好氧、污泥干化及附属区域的空气样本及相关构筑物内污水污泥做分析对照(如表1)。空气样品采用智能大流量TSP(PM10)采样器(2031型，青岛崂山应用技术研究所，中国青岛)采集，采样流量为1.05 m3·min-1，每个样品采样时长20 h，采样膜对折后取其面积的1/8提取DNA。污水污泥样品采用过滤或离心方式获得约0.5 g干泥提取DNA。DNA提取均采用试剂盒提取方法(Fast DNA kit for soil, MP, US)。

表1 采样信息表Table 1 Sampling information

1.2 实验方法

1.2.1 样品预处理

空气膜样品预处理，用消毒过的剪刀剪取适量样品膜(本研究使用的大流量TSP采样器滤膜尺寸230 mm×180 mm，可取1/8，膜面积约为50 cm2)，用镊子小心将滤膜最表层揭下。水样预处理，取一定量水样直接高速离心获取DNA或抽滤至滤膜上，将滤膜剪碎放入离心管中备用。将样品转移至试剂盒提供的Lysing Matix E管中，并参照MP Fast DNA Spin Kit for Soil试剂盒说明书提取样品DNA，并使用Nanodrop 2000检测样品浓度及纯度。

1.2.2 抗生素抗性基因分析

实验选用3大类8种抗生素抗性基因进行检测分析，采用PCR技术检测抗性基因，采用qPCR技术分别对四环素类抗性基因(tetG、tetX)和磺胺类抗性基因(sul1、sul2)进行定量研究，引物信息如表1-2所示。1.2.3 高通量数据分析方法

扩增测序区间为16S RNA片段V3-V4区域(F314，R805)，采用Qubit 2.0测定纯化后的PCR产物浓度，然后将不同样品按照1∶1的比例进行混合，最后将混合样品采用Illumina Miseq300PE技术进行基因文库构建与双末端(paired-end)测序，测序策略为300PE[15]。

本研究序列信息分析主要使用MOTHUR软件，用于2个方面：测序数据的预处理和操作分离单元(OTUs)的聚类。

数据预处理，首先使用make.contigs命令进行融合双末端序列，而后通过各样品barcode使数据回归样品，然后再通过get.group命令将数据分割为单个样品的序列和分组信息(fasta和group)文件。unique.seqs命令用于去除重复序列，可降低分析后续过程中冗余的计算量。用screen.seqs命令去除测序质量较差的序列。最后使用sub.sample命令对不同样品的序列条数进行统一，保证微生物信息分析的有效性。

OTUs的聚类，是在系统发生学研究或群体遗传学研究中，为了方便分析，人为给某一个分类单元(品系、种、属、分组等)设置的同一标志。Align命令可将样品的fasta格式的候选序列文件与比对数据库SILVA中同样格式的模板序列对齐。而使用Cluster命令就能用来给OTUs分派序列，通过OTUs分析，就可以知道样品中的微生物的种群亲缘程度、多样性和不同微生物的丰度。

2 结果与分析(Results and analysis)

2.1 抗性基因定性分析

本研究对污水厂空气、污水污泥共计21个样品的8种抗性基因(tetC、tetG、tetO、tetX、sul1、sul2、ermB、ermC)使用特征引物扩增后，利用凝胶电泳条带的有无来判断，样品的检出情况如下表3所示。

结果表明，污水厂污水等样品中ARGs的检出率均超过67%，5种ARGs检出率达90%以上，其中tetC、sul1、sul2、ermB检出率为100%；而污水厂空气样品检出率均超过50%，且在曝气池、污泥脱水间抗性基因检出率100%，因此这些区域空气质量应该予以重点关注。

表2 抗性基因qPCR引物信息Table 2 qPCR primer for antibiotic resistance genes analysis

2.2 抗性基因定量分析

选择tetG、tetX、sul1、sul2等4种抗性基因，对污水厂空气、污水污泥等样品进行定量PCR实验后，根据样品介质、区域差异统计结果如图1所示。

由图1中可知，空气样品中抗性基因相对浓度约为102～104copies·ng-1DNA，污水污泥样品中相对浓度为104～107copies·ng-1DNA。空气中微生物携带ARGs水平低于污水污泥微生物约2～3个数量级。在污水污泥样品中四环素抗性基因(tetG、tetX)的相对含量略高于磺胺类抗性基因(sul1、sul2)，而在空气介质中磺胺类抗性基因相对含量略高于四环素抗性基因。

根据取样功能区域的不同，污水厂空气样品抗性基因定量结果如图2所示。

表3 抗性基因定性结果Table 3 Qualitative results of antibiotic resistance genes (ARGs)

注：“+”表示检出，“-”表示未检出。

Note: ‘+’ positive, ‘-’negative.

图1 污水厂不同区域抗性基因分布

图2 污水厂空气介质抗性基因相对浓度分布

结果表明，在污水厂核心工艺单元(厌氧池、缺氧池、好氧池)区域空气样品抗性基因相对浓度高于其他区域，其中缺氧池(A5)的sul1、sul2浓度分别达到4.81×104 copies·ng-1DNA和5.0×104 copies·ng-1DNA，好氧池(A6)的tetX浓度达到了6.93×103 copies·ng-1 DNA。这可能是由于污水处理单元中增殖的携抗性基因的微生物逸散至空气介质中所致。

3 讨论(Discussion)

基于OTUs结果，采用PAST软件对所有样品进行主成分分析(principal coordinate analysis, PCoA)，并将样品进行聚类，用以初步研究不同样品间的相似性和差异性。对21个样品进行主成分分析结果如图3所示。

从图3中可以看出，21个样品主要聚为四簇。第I簇为活性污泥及干化污泥样品，第II簇为污水厂AAO工艺旁空气样，第III簇为预处理段进水和附近空气样品，第IV簇为其他区域空气样。第I簇与第II簇距离较小，表明污水处理工艺单元的活性污泥对其临近区域空气有较大的影响，活性污泥中的微生物可通过工艺单元转移至临近的空气介质中。同样结论在第III簇内部也可以得到验证，进水段空气中微生物与进水中的微生物有较高的亲缘性，可能是由于该厂预处理段中包含的曝气等工段在处理过程中将水中的微生物转移至空气介质中。第IV簇中包含的居民区空气样品与污水厂其他区域空气样品距离较小，表明污水厂附近居民区空气中微生物的种群特征与污水厂内部分区域无明显差异。

抗性基因定性结果显示，污水厂的污水、污泥和空气样品中含有高检出率的四环素类、磺胺类、大环内酯类抗性基因，这与相关抗生素在本地区的大量使用有较大的联系。污水厂及周边居民区空气样品中高浓度的抗性基因表明其污染在空气介质中已经达到了普遍的污染水平。空气抗性基因的定量结果显示，周边居民区空气样品抗性基因浓度与污水厂园区内空气样品浓度近似一致，且其浓度与距离污水处理工艺的距离有关，距离越大相差越大，故活性污泥中的抗性基因可能通过充氧曝气等过程转移至空气中，造成了局部污染。

通过高通量数据分析可知，污水厂厌氧、缺氧、好氧等工艺段活性污泥与其临近采样点的空气样品有较高的亲缘性，表明污水厂中曝气、跌水、干燥等处理单元可能将污水污泥中的微生物转移至空气中。污水厂园区内及周边居民区的空气样品有较高的亲缘性，可推断出2种原因，一为污水厂作为其附近空气介质微生物污染的源头，不仅影响到厂内更影响到了附近的居民区，二是污水厂区及周边居民区的空气微生物受到大区域的微生物污染影响达到一致水平，其中的具体机制还需要进一步的实验求证。

图3 不同样品基于Bray-Curtis距离的主成分分析

污水厂空气介质中的微生物及抗性基因污染具有隐秘性、长期性的特点，由此对周边居民健康产生的潜在威胁也极易被忽视，，因此对这一领域应该给予更多的关注和重视。

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Distribution of Airborne Antibiotic Resistance Gene in Wastewater Treatment Plant

Gao Xinlei1, Shao Mingfei1, He Xiaomeng1, Ouyang Feng1, Shang dandan2, Li Ji1,*

1． Harbin Institute of Technology Shenzhen Graduate School, Shenzhen Key Laboratory of Water Resource Utilization and Environmental Pollution Control, Shenzhen 518055, China

2． Shenzhen Branch of Beijing Guohuan Tsinghua Environment Engineering Design and Research Institute, Shenzhen 518049, China

Received 28 May 2015 accepted 26 August 2015

The pollution level and concentration distribution of the typical antibiotic resistance genes (ARGs) in the air of WWTP were investigated, then their affinity and emission sources were traced using 16S rRNA based high-throughput sequencing in the present study. Results showed that the positive detection rates were higher than 50% for the eight target ARGs in the air samples of WWTP and four of them (tetC,sul1,sul2 andermB) were 100%. Moreover, all the ARGs in the air samples were 100% detected near the aeration tank and sludge dewatering tank. The quantitative analysis of four ARGs (sul1,sul2,tetGandtetX) showed that their relative concentration range is 102～105copies·ng-1DNA, which was comparable with that of the air samples in the residential area nearby. Cluster analysis based on 16S rRNA high-throughput sequencing indicated that microbial community in the air in residential area had a high similarity with that in the WWTP, and treatment process in WWTP had a significant influence on the microbial composition of its ambient environment.

ARGs; airborne bacteria; wastewater treatment plant

环保公益性行业科研专项(201309031);国家自然科学基金(31200104)；深圳市基础研究计划(JCYJ2012061315435096)

高新磊(1987-)，男，博士研究生，研究方向为微生物气溶胶生化特征，E-mail:gaoxinleiuser@126.com

*通讯作者(Corresponding author)， E-mail: liji99@gmail.com

10.7524/AJE.1673-5897.20150528006

2015-05-28录用日期：2015-08-26

1673-5897(2015)5-089-06

X171.5

A

李继(1973-)，男，哈尔滨工业大学深圳研究生院教授、博导，主要研究方向为高排放标准城市污水处理工艺、工业废水处理、饮用水深度处理、空气污染微生物、抗生素耐药微生物及耐药基因，已发表学术论文70余篇。

高新磊, 邵明非, 贺小萌, 等. 污水处理厂空气介质抗生素抗性基因的分布[J]. 生态毒理学报，2015, 10(5): 89-94

Gao X L, Shao M F, He X M, et al. Distribution of airborne antibiotic resistance gene in wastewater treatment plant [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2015, 10(5): 89-94 (in Chinese)