流式细胞术在网织红细胞检测中的应用

张娇珍,王小敏，潘秀芳

(1.海南海口市中医医院检验科,570216；2.海南省第三人民医院检验科)



·论著·

流式细胞术在网织红细胞检测中的应用

张娇珍1,王小敏1，潘秀芳2

(1.海南海口市中医医院检验科,570216；2.海南省第三人民医院检验科)

[摘要]目的评价流式细胞仪测定外周血中网织红细胞的性能。方法选取门诊体检及住院患者共300例，随机选择血标本，采用FACSCalibur型流式细胞仪进行网织红细胞计数，分析其重复性，并与传统煌焦油蓝染色显微镜法进行对比及做相关分析。结果流式细胞仪法与传统煌焦油蓝显微镜法关于网织红细胞低值、中值及高值计数分别比较，均差异无统计学意义(P>0.05)；流式细胞仪的变异系数4.3%，传统煌焦油蓝显微镜法8.2%，两者比较差异有统计学意义(P<0.05),两种方法测定结果呈正相关关系(r=0.994,P<0.01)。结论流式细胞仪计数网织红细胞快速，结果准确，且重复性好，与传统煌焦油蓝染色显微镜法高度符合。

[关键词]流式细胞术;网状细胞;显微镜检查

网织红细胞(Ret)是介于晚幼红细胞与成熟红细胞之间尚未完全成熟的红细胞，是红细胞成熟过程的一个重要阶段，是反映骨髓造血功能的重要指标[1]。检测网织红细胞的相关参数对临床上众多疾病的诊断、治疗和监测有着重要的价值[2]。传统的检测方法为人工显微镜目测计数法，该方法操作费工、费时，受主观因素影响较大，重复性差[3]。近年来，随着荧光技术和流式细胞技术的发展及自动网织红细胞分析技术的革新，网织红细胞的测定自动化得到很大的发展。2014年3月至2014年7月我们采用BD公司FACSCalibur型流式细胞仪进行网织红细胞计数，并与传统煌焦油蓝染色显微镜法进行对比及相关分析，为今后临床相关疾病的诊断和治疗以及预后监测提供有效的、准确的及快捷的检测手段。

1资料与方法

1.1标本来源选取我院2014年3月至2014年7月门诊体检及住院患者共300例，其中健康体检者100例，单纯性血小板减少50例(<50×109/L)，缺铁性贫血50例，溶血性贫血50例，急性失血性性贫血60例，其他类贫血50例，采用乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K2)抗凝真空采血管取静脉血2 mL混匀，储存，试验时随机选取上述标本用于可比性分析。

1.2仪器与试剂日本OlympusBX-60型多功能光学显微镜，1%煌焦油蓝试剂，按《全国临床检验操作规程》第3版的要求配制[4],Miller窥盘，Beckman-Coulter XLMCL流式细胞仪为美国Beckman-Coulter产品及原装配套试剂。

1.3方法

1.3.1传统煌焦油蓝显微镜法按《全国临床检验操作规程》[4]，用煌焦油蓝染液对红细胞进行活体染色，每份标本由两名熟练的、有经验的检验技师在油镜下计数l 000个红细胞，获得网织红细胞计数结果，取平均值。

1.3.2流式细胞仪检测法将标本试管顺序编号，制备阴性对照管。对照管中加入含0.1%NaN3的PBS缓冲液1 mL和5 μL全血。试验管中加入Retic-COUNT试剂1 mL和5 μL全血，充分混匀。室温暗处温育30 min，4 h内上机分析，分析前充分混匀上样管。上流式细胞仪以Cellquest软件获取50 000个红细胞，以低角度、高角度散射光对数点图设红细胞门，对照管调节电压获取阴性Marker，记录并分析网织红细胞平均荧光强度。试验人员经过厂家培训，严格按仪器操作规程做网织红细胞分析，按照仪器操作规程，用配套校准品作仪器校正，当日用配套的全血质控物(低、中、高)进行室内质控，各参数结果均在其靶值允许的范围内。

1.3.3重复性试验取高、中、低值3份标本，用FACSCalibur流式细胞仪平行测试30次，同时进行煌焦油蓝染色，每份推30张薄片油镜下计数1000个红细胞，分别计算出每份标本网织红细胞计数的均值、标准差及变异系数(CV)。

1.3.4相关性试验随机取100份标本，在用流式细胞仪法测定网织红细胞的同时做传统煌焦油蓝染色显微镜目测计数，每份标本制作2张血片，由两名有经验的检验师分别在油镜下计数1000个红细胞，取均值将两者结果进行比较。

1.4统计学处理采用SPSS18.0软件进行分析，两样本比较采用独立样本t检验，符合正态分布计数资料采用χ2检验。

2结果

2.1流式细胞仪测定与传统煌焦油蓝显微镜法测定相关性评价结果结果显示，两种方法测定结果呈正相关关系(r=0.994,P<0.01)，直线回归方程为Y=0.870X-0.211。

2.2两种方法重复性试验结果比较流式细胞仪法与传统煌焦油蓝显微镜法低值、中值及高值计数比较计数分别比较，均差异无统计学意义(P>0.05)；流式细胞仪的变异系数4.3%，传统煌焦油蓝显微镜法8.2%，两者比较差异有统计学意义(P<0.05),见表1。

3讨论

红细胞在骨髓中生成，需经历祖细胞、干细胞、原始红细胞、早幼红细胞、中幼红细胞、晚幼红细胞、网织红细胞，最后发育为成熟红细胞，网织红细胞是红细胞成熟过程中的一个重要阶段，是判断骨髓红系造血情况和疗效观察的重要指标[5]。在不同阶段的红细胞的发展过程中，随着红细胞的成熟，其颜色变化会逐渐从蓝色转变为含有更多血红蛋白成分的粉红色细胞，而其所含的核糖核酸(RNA)成分也会相应减少。网织红细胞是有核红细胞刚刚失去核的阶段，仍属未完全成熟的红细胞，介于晚幼红细胞和成熟红细胞之间的过渡段细胞，其胞质中残存的嗜碱性物质RNA等源自有核红细胞，这种嗜碱性物质经碱性染料活体染色后，形成蓝色或紫色的点粒状或丝网状结构沉淀物，经煌焦油蓝活体染色后，在包体内可见蓝色点状或网状结构[6]，据此特性衍生出了多种检测网织红细胞的方法。现其检测方法有传统的显微镜目测法，又有仪器计数法，如网织红细胞计数仪、血细胞分析仪及流式细胞仪等。传统检测网织红细胞百分比是手工计数1000个经煌焦油蓝或新亚甲蓝活体染色细胞，胞质中可见核酸与碱性染料复合物，并计算其个数，存在诸多缺点，如手工染色方法由于操作环节多、人为影响因素大，其重复性和准确性均有限[7]。我们结果显示流式细胞仪法与传统煌焦油蓝显微镜法低值、中值及高值计数分别比较，均差异无统计学意义(P>0.05)，两种方法测定结果呈正相关关系(r=0.994，P<0.01)，然而流式细胞仪的变异系数4.3%，传统煌焦油蓝显微镜法8.2%，两者比较差异有统计学意义(P<0.01)，即流式细胞仪的变异系数明显低于传统煌焦油蓝显微镜法法。

表1　流式细胞仪及传统煌焦油蓝显微镜法重复性试验结果比较

流式细胞仪检测法是一种对细胞进行自动分析的高技术、其特点是快速、准确-每秒可测数千至上万个细胞，短时间内可以得到大量相关的信息，因此在存学科领域越来越受到人们的重视[8-9]。既往有研究证实流式细胞仪检测法的精密度比手工法高，且可在数秒中检测1000～1500 个/s以上的红细胞，避免了因细胞计数不足而致结果偏差的影响，结果的准确性也有所提高[10]；我们的观察结果与此相近。另外，流式细胞仪检测法不但可以计数网织红细胞，还可以测定网织红细胞中残留RNA的荧光强度值，对于骨髓移植、化疗后造血功能恢复的监测极其灵敏，是一种极早性提示指标，可作为骨髓移植治疗、化疗的监测指标，尤其是对骨髓移植后的早期监测具有重要意义[11]。

流式细胞仪检测法在一定程度上也有其自身的局限性，其最大缺点是易受白细胞、JolIy小体、疟原虫和血小板的干扰，特别是白血病和白细胞增多的患者，其干扰主要表现在空白对照波峰拖尾、阳性区异常波峰[12]。因此，虽然流式细胞仪检测法虽较传统法有较大的改进，但仍不能偏废传统血片的检查。传统煌焦油蓝显微镜法目前仍然是国内外网织红细胞计数的经典方法，其操作简便，试剂成本低廉，镜下细胞形态直观，因而仍然被广泛应用。我们要做的是在临床工作中，做到两者有机的结合，充分利用两种方法的优点，更好地为临床服务。

参考文献

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[12] 熊见,解小红,王长本,等.流式细胞术检测网织红细胞的多参数分析及方法评价[J].检验医学与临床,2010,7(13):1295-1296,1298.

Application of flow cytometry for reticulocyte detection

ZHANGJiaozhen*,WANGXiaomin，PANXiufang

(*LaboratoryMedicineDepartment,HaikouTCMHospital,Haikou570216,China)

[Abstract]Objectives To evaluate the flow cytometric in reticulocyte detection of peripheral blood.MethodsA total of 300 cases of outpatient and hospitalizd patients were selected in our hospital from March 2014 to July 2014.Reticulocyte of random blood samples were detected by FACSCalibur flow cytometry.The repetition of FACSCalibur flow cytometry was analyzed and the correlation analyzed between FACSCalibur flow cytometry and traditional brilliant cresyl blue staining microscopy.ResultsThere were all no significant differences about the reticulocyte counting of low,median and high value between FACSCalibur flow cytometry and traditional brilliant cresyl blue staining microscopy respectively.The coefficient of variation of flow cytometry was 4.3% and that the traditional brilliant cresyl blue staining microscopy was 8.2%.There was significant difference between two methods (P<0.05).The correlation between the determination results of FACSCalibur flow cytometry and traditional brilliant cresyl blue staining microscopy was positive(r=0.994,P<0.01).ConclusionReticulocyte counting by Flow cytometric is fast,accurate,and good reproducibility.The results of reticulocyte counting by Flow cytometric are highly consistent with the traditional brilliant cresyl blue staining microscopy.

[Key words]Flow cytometry;Reticulocytes;Microscopy

(收稿日期：2014-10-20)

中图分类号：R446.113

文献标识码：A

DOI:10.3969/J.issn.1672-6790.2015.01.015

作者简介：张娇珍,主管检验师,Email:zjz0216@163.com