miR-199在对顺铂敏感性不同的卵巢癌细胞株中的表达及其意义

柳长青，徐汉杰，周颖，赵卫东

(1.安徽医科大学附属省立医院、安徽省立医院，合肥 230001；2.安徽省分子医学重点实验室；3.安徽省肿瘤医院)



·基础研究·

miR-199在对顺铂敏感性不同的卵巢癌细胞株中的表达及其意义

柳长青1,3，徐汉杰1,2，周颖2，赵卫东1,3

(1.安徽医科大学附属省立医院、安徽省立医院，合肥 230001；2.安徽省分子医学重点实验室；3.安徽省肿瘤医院)

[摘要]目的探讨miR-199在卵巢癌细胞株中的表达，寻找卵巢癌化疗敏感性的指标。方法组学分析找出在顺铂敏感性不同的卵巢癌细胞株， miR-199的表达量差异较为显著，qRT-PCR和western blot方法检测瞬时转染miR199 mimic/antagomir后的卵巢癌细胞株,P63表达水平发生显著变化。结果miR-199在对顺铂耐药的ES-2细胞中表达水平高于在对顺铂耐药的SKOV3细胞中的表达，miR-199的下游蛋白P63的表达也有差异。结论miR-199与P63在一定程度上可以预测卵巢癌顺铂化疗敏感性， miR-199可能是通过其下游靶基因P63发挥其在卵巢癌顺铂化疗敏感性中的作用。

[关键词]卵巢肿瘤；抗药性，肿瘤；顺铂；紫杉酚；氟尿嘧啶

人们通过对癌症耐药机制的深入研究，渐渐认识到卵巢癌的耐药不仅与基因突变等遗传学机制有关，也与表观遗传学异常密切相关[1-4]。近几年来，DNA甲基化组学、mRNA组学以及蛋白组学的不断研究发展，更为检验出与癌症相关异常表达的因子提供了方便[3]。此次研究中，我们借助组学分析及qRT-PCR等技术手段分析miR-199在顺铂敏感度差异性较大的SKOV3和ES-2卵巢癌细胞系中的表达情况，为寻找预测卵巢癌化疗敏感性指标及耐药机制提供新的方向。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞系ES-2(上海细胞库：NO.C0585)COC1(北京肿瘤医院细胞库：NO.HB-5606)COC2(北京肿瘤医院细胞库：NO.HB-5607)，SKOV3和HO8910均来自安徽省立医院分子生物学实验室。

1.1.2化疗药物紫杉醇注射液(paclitaxel，北京双鹭药业股份有限公司)，5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,上海旭东海普药业有限公司)，顺铂注射液(cisplatin，江苏豪森药业股份有限公司)，注射用奈达铂(nedaplatin，江苏奥康赛药业股份有限公司)，多西他赛注射液(docetaxel，江苏奥康赛药业股份有限公司)，注射用丝裂霉素(mitomycin，浙江海正药业股份有限公司)。

1.2实验方法

1.2.1细胞培养卵巢癌细胞系在含10%胎牛血清的双抗(100 u/mL青霉素和100 mg/mL链霉素)DMEM培养基中，于37℃、5%CO2恒温箱内培养，取对数生长期细胞进行相关实验。

1.2.2qRT-PCRTRIzol法提取细胞的总RNA，无RNA 酶的DNA 酶I处理RNA 中污染的DNA，样品经过酚和氯仿抽提后，溶解于DEPC 处理的水中，提取的细胞总RNA 5 ug与1 μL 100mM Oligo(dT)，1 uL 10mM dNTPs混合，65 ℃加热5 min后，立即冰上放置5 min。在冰上预冷RNase free反应管内加入以下试剂至总体积25 μL。混匀，离心后在室温下反应1 h，接着85℃ 10 min 灭活处理。样品储存于-20 ℃。用SYBR®PCR分析仪对RNA水平进行检测。P63引物信息如下表1。

表1　P63引物信息

1.2.3Western blot 细胞收蛋白，定量蛋白用SDS-polyacrylamide gel分离后，转移到PVDF膜上。一抗(1:500)过夜，加二抗，1 h后HRP化学发光、显影。GAPDH作为内参。Tanon 6200显影拍照。显影图片用Smartview分析软件进行密度分析扫描。

1.2.4核酸的瞬时转染(Lipofectamine 2000)(1)转染前1天，胰酶消化细胞并计数，细胞铺板，使其在转染日密度为90%~95%。细胞铺板在2 mL双无DMEM培养基中。(2)对于每孔细胞，使用250 μL无血清的DMEM培养基稀释4.0 μg DNA，轻轻混匀。(3)使用前将Lipofectamine 2000转染试剂轻轻混匀，用250μL DMEM培养基稀释10 μL Lipofectamine 2000转染试剂，轻轻混匀。Lipofectamine 2000稀释后，在5 min内同稀释的DNA混合。(4)混合稀释的DNA(第2步)和稀释的Lipofectamine 2000(第3步)。室温放置20 min。弃液，无血清培养基清洗2次。(5)直接将复合物加入到每孔中，摇动培养板，轻轻混匀。在37 ℃，5%CO2中保温4~6 h后，加入完全培养基继续培养。

2结果

2.1IC50值的比较SKOV3和ES-2细胞对顺铂(DDP)敏感性差异最大(IC50比值=124.52，图1)；其他几种化疗药物的敏感性差别较小：IC50比值较低，分别为紫杉醇(4.25)，5-氟尿嘧啶(1.96)，奈达铂(2.12)，丝裂霉素(2.44)和多西他赛(25.34)。IC50相对数值见表2。

表2　化疗药物在卵巢细胞的相对IC50值

2.2化疗敏感性不同的卵巢癌细胞间的miR差异性表达miRNA表达谱的测序结果显示miR-199在COC1、COC2和ES-2细胞表达高于SKOV-3中的表达：分别为955,377,1245和70，差异显著(见图2)。相反，我们另外设置一个作为对照的无关miRNA，即miR-127-3p，它在各个卵巢癌细胞系中的resds值很低，且无差异。

2.3miR-199在SKOV3和ES-2细胞系中的表达情况qRT-PCR检测miR-199在ES-2、SKOV-3卵巢癌细胞系中的表达设miR-199在SKOV3相对表达水平为1.00，则ES-2的表达水平为5.27(P=0.024)，与miR表达谱的测序的结果一致(见图2，图3)。

2.4miR-199下游基因P63在SKOV3和 ES-2细胞系中的表达Western blot检测结果显示P63在SKOV3中的表达水平高于在ES-2细胞中(见图4)。在SKOV3和ES-2卵巢癌细胞株中转染miR-199-mimic/antagomir后检测P63的mRNA及蛋白表达水平。

qRT-PCR结果显示转染miR-199 mimic的SKOV3细胞中，P63的mRNA水平是降低的(ABCC8不是miR-199的靶基因，作为第二内参)，转染miR-199 antagomir的ES-2细胞，其mRNA表达水平升高(见图5)。可以看出，人为地改变miR-199地水平对于P63地mRNA水平有影响，但是不能改变ABCC8的mRNA水平。

Western blot结果显示转染miR-199 mimic的SKOV3细胞中，P63的相对表达降低，转染miR-199 antagomir的ES-2细胞，P63的表示水平则增高(见图6)。结合上述结果，说明P63基因直接受到miR-199的调控，是miR-199的靶基因。

3讨论

目前，临床上缺乏有效预测卵巢癌对于化疗药物敏感性方法，使得盲目和过度化疗在所难免。因此，考虑到能够发现有效预测化疗耐受性的分子标记是迫切需要解决的，基础和转化医学的研究越来越备受关注。在分子水平上，国内外科研人员发现了许多可作用于卵巢癌发病机制的通路和基因[5]。其中，miRNA的众多下游基因的表达调控与卵巢癌的发生发展以及耐药性有一定关系[6]。

miRNAS是调节目的基因转录后的非编码RNA，在广泛的物种中状态稳定，通常参与转录后的基因调控。miRNAS通过绑定特定的3′-UTR区来负调控基因的表达。由于miRNA不需要特异性的结合位点和识别短小片段来扩展5′-seed区域，一个miRNA可以调节数以百计个miRNAs，多个miRNAs同样也可以共同调控一个miRNA[7]。miRNAs预计监管大约60%的人类基因，参与基因的调控作用，如发生发展、分化、代谢、增殖、细胞周期、炎症和免疫系统调节[8]。目前，众所周知miRNAs在癌症中可以上调和下调。超表达的miRNAS可下调肿瘤抑制基因的表达，而表达下调的miRNAS可作为肿瘤抑制因子负调节致癌基因[9]。Let-7家族在各种肿瘤中表达下调，从而作为肿瘤抑制因子出现[10]。miR-15和miR-16的靶基因BCL2是一种致癌基因，下调BCL2会导致白血病细胞的凋亡[11]。也有一些证据证明miR-199负调控其下游靶基因导致肿瘤细胞耐药性的改变，但是其作用还有待于进一步研究[12]。以上研究结果只代表一小部分科研人员强调miRNAS在各种恶性肿瘤以及癌症生物学中的作用。

为了阐述卵巢癌细胞耐药的机制，我们对5种卵巢癌细胞系分别进行6种临床常见化疗药物进行敏感性实验分析。通过测得每种细胞的IC50值，我们发现SKOV3和ES-2两株细胞系对顺铂的敏感性相对其他株细胞系，具有显著的差异。我们猜想对同一种药物有如此明显差异的两株细胞系，其内必有导致产生这种现象的非人为因素，具有进一步研究的价值。

由于miRNA的众多下游基因的表达调控与卵巢癌的耐药性有一定关系，且参与卵巢癌耐药性的基因受到miRNA的调节，例如：miR-29转录后水平调节DMNT3B的表达[9]。因此，我们从该调控机制出发，研究卵巢癌细胞系对DDP耐药性的机制，希望找出新的可以指导临床的耐药机制。我们分析比较了SKOV3和ES-2的miR表达谱式，筛选出几十个表达差异明显的miR，其中我们选择了差异性最为明显的miR-199来进行研究。

我们用Solexa二代深度测序技术绘制4种卵巢癌细胞系：COC1、COC2、SKOV3和ES-2的miR表达谱，在有差异性表达的数十个miR中，miR-199的表达水平与卵巢癌细胞系的顺铂化疗敏感性相关性尤为紧密。接着我们通过qRT-PCR复测miR-199在顺铂敏感性差异较大的两株卵巢癌细胞系的表达情况，其表达水平与miR表达谱的测序结果一致，miR-199的表达高低与卵巢癌的顺铂的敏感性密切相关。

众多研究报道，P63的生物学功能在转录调控、细胞凋亡以及肿瘤发生发展中占据重要地位[8,13]，尤其是参与细胞凋亡方面，考虑到凋亡蛋白与化疗药物敏感性之间的关系，我们猜想P63的表达改变或许就是影响卵巢癌细胞顺铂敏感性的“钥匙”。接着我们通过查阅大量文献和相关网站搜索，发现P63在SKOV3和ES-2中的蛋白表达趋势与理论预测相符合，猜想P63与miR-199具有一定的相关性。接着，我们瞬转miR-199 mimic到SKOV3细胞中，P63的mRNA和蛋白表达水平均降低；而瞬转miR-199 antagomir到ES-2细胞中，P63的mRNA和蛋白表达水平均上扬，进一步证实了猜想的准确性。至此，我们的研究基本确定了miR-199负调控其下游靶基因P63参与卵巢癌顺铂耐药性的改变，但是除了P63基因外，也许还有其它miR基因参与调控，这些将是我们下一步需要考虑研究的方向。

(本文图1~6见插图3-1)

参考文献

[1]Sénéchal C,de Pauw A,Elan CL,et al.Environmental and genetic risk factors for endometrial carcinoma[J].Bull Cancer,2015,102(3):256-269.

[2]Morrison J,Haldar K,Kehoe S,et al.Chemotherapy versus surgery for initial treatment in advanced ovarian epithelial cancer[J/OL].Cochrane Database Syst Rev,DOI:10.1002/14651858.CD005343.pub2.

[3]Pogońska P,Wydra D,Serkies K,et al.Chemosensitivity testing in ovarian cancer-prospects for the future[J].Ginekol Pol,2014,85(9):695-698.

[4]Siegel RJ,Zou M,Jemal A.Cancer statistics[J].C A Cancer J Clin,2014,64(1):9-29.

[5]Buys SS,Partridge E,Black A,et al.Effect of screening on ovarian cancer mortality: the Prostate,Lung,Colorectal and Ovarian (PLCO) cancer screening randomized controlled trial[J].JAMA,2011,305(22):2295-2303.

[6]Ozols RF,Bundy BN,Greer BE,et al.Phase III trial of carboplatin and paclitaxel compared with cisplatin and paclitaxel in patients with optimally resected stage III ovarian cancer: a gynecologic oncology group study[J].J Clin Oncol,2003,21(17):3194-3200.

[7]Lewis BP,Shih IH,Jones-Rhoades MW,et al.Prediction of mammalian MicroRNA targets[J].Cell,2003,115(7):787-798.

[8]Di Leva G,Garofalo M,Croce CM.MicroRNAs in cancer[J].Annu RevPathol,2014,32(9):287-314.

[9]Ruan K,Fang X,Ouyang G.MicroRNAs: novel regulators in the hallmarks of human cancer[J].Cancer Lett,2009,285(2):116-126.

[10] Johnson SM,Grosshans H,Shingara J,et al.RAS is regulated by the let-7 microRNA family[J].Cell,2005,120(5):635-647.

[11] Cimmino A,Calin GA,Fabbri M,et al.miR-15 and miR-16 induce apoptosis by targeting BCL2[J].Proc Natl Acad Sci USA,2005,102(39):13944-13949.

[12] He L,He X,Lim LP,de Stanchina E,et al.A microRNA component of the p53 tumour suppressor network[J].Nature,2007,447(7148):1130-1134.

[13] Fletcher JI,Haber M,Henderson MJ,et al.ABC transporters in cancer: more than just drug efflux pumps[J].Nat Rev Cancer,2010,10(2):147-156.

The expression and significance of miR-199 in ovarian cancer cell lines

LiuChangqing*,XuHanjie,ZhouYing,ZhaoWeidong

(*AnhuiProvincialHospitalAffiliatedtoAnhuiMedicalUniversity,Hefei230001,China)

[Abstract]ObjectiveIn this study,we aimed to detect the expression of miR - 199 and searched for chemotherapy sensitivity of indicators in ovarian cancer cell lines and.Methods Omics analysis had found that in ovarian cancer cell lines which had different sensitivities to cisplatin,the difference of expression of miR - 199 is significant.Then used specificity methylation PCR and western blot to verify the expression level of P63 gene in ovarian cancer cell lines of the transient transfection miR199 mimic/antagomir.ResultsThe expression level of miR-199 in ES-2 is much higher than in the expression of SKOV3 cells.The expression of p63 is negatively correlated with the expression of miR-199.ConclusionsmiR-199 and P63 may predict the sensitivity to cisplatin chemotherapy to some extent.miR-199 may effect the sensitivity to cisplatin chemotherapy of ovarian cancer by regulating its downstream target genes P63.

[Key words]Ovarian neoplasms；Drug resistance，neoplasm；Cisplatin；Paclitaxel；Fluorouracil

(收稿日期:2015-04-22)

Corresponding author:Zhao Weidong,Email：victorzhao@163.com

通信作者：赵卫东，副教授，主任医师，硕士生导师，Email:victorzhao@163.com

作者简介：柳长青，硕士在读，Email：aydlcq@126.com

基金项目：国家自然科学基金(81272881)；安徽省科技攻关计划项目(08010302101)

中图分类号：R737.31

文献标识码：A

DOI:10.3969/J.issn.1672-6790.2015.03.021