P16蛋白在骨肉瘤新辅助化疗效果预测中的价值

朱伟民，周广福，唐本森，严贤科，李暻



论著·临床

P16蛋白在骨肉瘤新辅助化疗效果预测中的价值

朱伟民，周广福，唐本森，严贤科，李暻

目的 观察P16蛋白表达在骨肉瘤(OS)患者新辅助化疗效果预测中的价值。方法 骨肉瘤患者40例，术前均进行了药物辅助化疗，通过手术标本及组织活检构建石蜡包埋组织芯片40例，采用免疫组化染色法对P16的表达进行分析。当>30%的细胞核着色时为P16阳性。对化疗后手术切除的38例标本进行分析，≥90%的肿瘤坏死时为良，<90%为差。统计患者性别、年龄、肿瘤部位以及组织病理类型与肿瘤坏死之间的关系。采用单因素和多因素分析法进行分析。结果P16总体表达率为62.5%(25/40)，治疗后肿瘤中位坏死率为95.0%，57.9%(22/38)的手术患者化疗反应为“良”。单因素分析表明：P16阳性表达患者中位坏死率以及化疗反应评“良”率高于P16阴性患者(P<0.01)。Logistic回归分析表明：P16是反映骨肿瘤细胞对药物化疗反应的独立预测因素(OR=43.50，CI2.64～708.90，P=0.01)，与患者的年龄、肿瘤类型、性别、部位无关。结论P16的表达同骨肉瘤药物化疗效果显著相关，可作为一种分子标志物用于对术前进行化疗患者的首选。

骨肉瘤；化疗反应；P16蛋白

【DOI】 10.3969 /j.issn.1671-6450.2015.04.012

骨肉瘤(osteosarcoma，OS)为青少年常见肿瘤，发病率约为2.4%，其中56%为恶性骨肿瘤。从20世纪70年代开始，化疗药物开始应用于骨肉瘤患者，并且取得了显著的疗效。新辅助化疗实质上是术前应用化疗，在治疗微小转移灶的同时，控制肿瘤原发灶以利于保肢手术的进行，降低局部复发率，并根据骨肉瘤对化疗的反应调整术后的化疗方案[1]。尽管这些化疗方案都取得了一定程度的成功，但仍有少数患者对化疗没有反应。因此如何对新辅助化疗效果进行预测，防止延误病情是目前研究的热点。

P16是细胞周期中非常重要的调节因子, 在多种肿瘤细胞周期增殖和细胞分化调控中起着十分重要的作用[2]。P16是常见的细胞周期依赖性蛋白激酶4抑制因子，当其发生突变、缺失、启动子去甲基化时导致失活，往往伴随较差的预后[3]。本研究通过观察P16的表达与骨肉瘤术前化疗疗效的关系，为临床骨肉瘤患者是否进行术前化疗提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 2008年1月—2010年12月贵州省骨科医院骨科手术治疗原发性OS患者40例，均符合《软组织与骨肿瘤病理学与遗传学》中的诊断标准[3]；患者术前均进行了新辅助化疗。40例中男19例，女21例，年龄9～75岁，中位年龄15岁；病程1～18个月，中位病程4.5个月；无家族遗传史。肿瘤部位：股骨14例(35.0%)，胫骨11例(27.5%)，肱骨5例(12.5%)，其他部位7例(17.5%)，另3例患者无肿瘤部位记录(7.5%)。病理类型：成骨细胞型23例(57.5%)，软骨细胞型5例(12.5%)，成纤维细胞型4例(10.0%)，其他类型3例(7.5%)，5例患者无病理分型(12.5%)。术前活检：40例患者均为高分化OS。本研究获得我院医学伦理委员会同意，患者或家属均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 新辅助化疗： OS新辅助化疗用药方案主要为大剂量甲氨蝶呤(HD-MTX)、阿霉素(ADM)、顺铂(CDP)和异环磷酰胺(IFO)等4种药物。用药方法：前2周每周给予MTX 8～12 g/m2、CDP 120 mg/m2，连用12次，间隔1周后再予IFO 2 g/m2连用5 d；ADM 30 mg/m2，连用3 d，间隔2周后进行第2次化疗，术前化疗3次。在明确诊断后的第11～12周进行手术。收集相关资料：性别、年龄、肿瘤部位、组织学类型、肿瘤坏死率。根据世界卫生组织软组织和骨肿瘤分类标准对肿瘤进行病理学诊断[4]。按照Huvos标准(肿瘤坏死的总表面积占整个骨横切面的面积百分比)对化疗后肿瘤坏死程度进行评估，当肿瘤坏死面积≥90%为化疗反应良，<90%为差[5]。

1.2.2 P16蛋白检测： 对OS患者40例(2例患者未进行手术，仅行组织活检)的肿瘤组织标本用福尔马林固定，石蜡包埋。取每个肿瘤样本组织中心部位放进石蜡包埋的接受器中，制备组织微阵列(tissue microarray，TMA)。每个患者至少采用直径为3 mm的中心组织2个用于构建微阵列，切片机切成组织薄片，并进行免疫组织化学(immunohistochemical，IHC)染色。将TMA石蜡切片于60℃处理20 min，采用生物素—亲和素辣根过氧化物酶体复合物法对P16进行染色，试剂为鼠抗P16单克隆抗体(Sigma公司)。以人宫颈黏膜作为阳性对照，人肾组织为阴性对照。TMA切片经过3位骨科病理医师阅片，对P16表达程度进行评分(对每个患者反复评分直到得到一致的结果，细胞浆中染色不计)。P16阳性表达在肿瘤中分布较为均一，阴性表达为细胞核无着色(图1见封3)。按阳性细胞面积占整张切片面积的比例进行分析，当细胞核着色大于30%时为阳性。

1.3 统计学方法 采用SPSS 15.0软件对数据进行分析。计量资料以均数±标准差表示，比较采用独立样本t检验；非参数连续变量以中位值表示，并用Mann-WhitneyU检验。分类变量用χ2检验或Fisher精确检验法。采用Logistic回归分析化疗反应的预测变量。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 免疫组化染色分析及病理性坏死反应 化疗后对肿瘤坏死程度进行评估，22例(57.9%)患者化疗反应为良；16例(42.1%)化疗反应差，另外2例患者因肿瘤扩散无法切除，仅取活检进行病理检测。P16在肿瘤组织中阳性表达25例(62.5%)，阴性表达15例(37.5%)。见表1。

P16阳性肿瘤患者的中位坏死率和良化疗反应率明显高于P16阴性者(P<0.01)。P16阳性和阴性患者的年龄、组织病理类型、肿瘤部位无显著统计学差异。男性患者中，P16表达率虽高于女性，但是差异无统计学意义(60.0%vs. 40.0%，P>0.05)。见表1。

表1 P16阳性和阴性患者临床病理特征的比较

2.2 化疗反应的相关因素分析P16的表达与新辅助化疗为“良”显著相关(OR=43.50，95%CI2.64～708.90，P=0.01)，而新辅助化疗效果与患者的性别、年龄、组织病理类型、肿瘤部位等因素没有关系，因而P16的表达可以作为新辅助化疗效果的预测指标。见表2。

表2 临床病理特征与OS患者接受新辅助化疗肿瘤 坏死的Logistic回归分析

3 讨 论

随着多种新型化疗药物的应用以及化疗方式的改进，对OS患者的治疗已有很大发展，5年生存率已从15%～20%增加到55%～80%[6，7]，因此新辅助化疗已成为很多患者在手术前的首选治疗方式。本研究发现40例OS患者中，22例患者化疗反应为良(肿瘤坏死≥90%)；16例患者化疗反应差(肿瘤坏死<90%)，提示仍有一部分患者对化疗无反应，因此如何对新辅助化疗效果进行事前预测很有意义。

目前尽管已有多个生物标志物可用于预测OS化疗后的生存期，包括P-糖蛋白、Ki-67、HER2等，但这些标志物同OS化疗效果的关系不明显。例如，Roe-sler等[8]报道了92例OS患者手术和化疗的治疗效果，发现肿瘤中P-糖蛋白升高与预后差不相关，这其中就包括转移以及肉瘤引起的死亡患者。此外有研究还证明P-糖蛋白与化疗后坏死反应的降低也无相关性，而HER2、Ki-67与OS生存期短也无明显关系[9]。

细胞周期素和细胞周期素依赖性激酶 (cycline-dependentkinases，CDKs) 是细胞周期进程的核心元件。目前发现编码CDKs抑制剂的基因是抑癌基因P16,其为许多化疗药物作用靶点[10]。因此我们推断P16的表达可能与化疗药物的疗效相关。目前报道推荐以肿瘤坏死反应≥90%作为辅助化疗的疗效判断标准，可用于预测生存[11]。因此我们用IHC法检测了OS患者癌组织中P16的表达。P16在40例OS患者中阳性表达25例，阴性表达15例。而且，P16阳性肿瘤患者中，中位坏死率和化疗良反应明显高于阴性者，15例P16阴性表达的患者化疗坏死反应率低。通过后期的随访，本研究中患者化疗反应好的往往生存周期比较长。回归分析也表明：P16的表达是化疗反应的独立预测因素，同年龄、肿瘤类型、性别、部位无关(OR=43.50，95%CI2.64～708.90，P=0.01)。结果说明P16的表达与OS患者肿瘤细胞对化疗反应敏感程度相关，这一结果同Umbreit等[12]研究结果相同，他们发现P16的表达同OS患者综合治疗后预后差相关。也有研究报道，P16 蛋白的失活可能促进OS的恶性进展过程,P16 蛋白的表达和肿瘤细胞凋亡有关，可作为判断骨肉瘤恶性程度和预测预后的重要参考指标[13]。 本研究37.5%的OS患者P16阴性表达，分析P16表达的差异可能受到患者遗传差异的影响。研究发现OS患者中有G1期检验点调控蛋白的异常。例如，有超过60%的OS患者在染色体13q14处有杂合性丢失，7%～23%的OS患者P16基因突变[14]。Jiang等[15]在15例不表达P16的OS患者中能够检测到P16的突变，而其中12例该基因启动子区部分或全部甲基化。因此仍需要进一步研究分析基因型和表型之间的联系以及P16的表达和缺失同临床预后的关系。

本研究观察到在成骨细胞型患者中，P16的表达较高，但差异无统计学意义，还发现组织病理类型不是化疗反应的预测因子，分析其可能原因是本研究的样本量较小，而P16的表达同化疗治疗反应的联系更为紧密一些，但仍需要进一步大数据的研究。

总之，我们证明了P16的表达与OS药物化疗反应性显著相关。P16可以作为一种判断是否对OS进行化疗的标志物，在治疗前选择性地对P16阳性的患者进行治疗，将有助对于提高药物治疗的疗效，而阴性患者可能不适合进行术前药物化疗。

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2Al-MohannaMA,ManogaranPS,Al-MukhalafiZ,etal.Thetumorsuppressorp16(INK4a)geneisaregulatorofapoptosisinducedbyultravioletlightandcisplatin[J].Oncogene,2004,23(1):201-212.

3ChristopherDM,FletcherKK,FredrikM.软组织与骨肿瘤病理学与遗传学[M].北京:人民卫生出版社,2006:398.

4 方三高,肖华亮,周晓军.WHO(2013)骨肿瘤分类的新成员[J].诊断病理学杂志,2014,21(4):251-255.

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12UmbreitC,AderholdC,FaberA,etal.Unexpectedalterationofβ-cateninandc-KITexpressionby5-FUanddocetaxelinp16-positivesquamouscellcarcinomacomparedtoHPV-negativeHNSCCcellsinvitro[J].AnticancerRes,2013,33(6):2457-2465.

13 何武兵,陈丽红,张旭鸣,等.骨肉瘤中P16蛋白的表达及其与细胞凋亡的关系[J].福建医科大学学报,2010,44(6):429-432.

14MohsenyAB,SzuhaiK,RomeoS,etal.OsteosarcomaoriginatesfrommesenchymalstemcellsinconsequenceofaneuploidizationandgenomiclossofCdkn2[J].JPathol,2009,219(3):294-305.

15JiangR,GaoZL,SunM,etal.ZincfingerX-chromosomalproteinpromotesgrowthandtumorigenesisinhumanosteosarcomacells[J].PakJMedSci,2013,29(4):997-1002.

Predictive value of P16 protein on adjuvant chemotherapy effect in patients with osteosarcoma

ZHUWeimin,ZHOUGuangfu,TANGBensen,YANXianke,LIJing.

DepartmentofOsteoarthropathy,GuizhouOrthopedicsHospital,Guiyang550007,China

Objective To study the predictive value of P16 protein expression in osteosarcoma(OS) patients under neoadjuvant chemotherapy.Methods 40 patients with OS were selected,all patients received durg adjuvant chemotherapy,paraffin embedded chips were established through the operation specimens and biopsy,immunohistochemistry staining method was used to analyze the expression of P16. P16 was positive when nuclear stained were more than 30%. The resection specimens of 38 patients after chemotherapy were analyzed to determine tumor necrosis percentage, when tumor necrosis was more than 90% it’s good, when tumor necrosis was less than 90%, it’s bad. The relationship between patient gender, age, tumor location, pathological type and tumor necrosis were analyzed using single factor and multiply factor analysis.Results The expression rate of P16 was 62.5%(25/40), after treatment the median tumor necrosis rate was 95.0%,57.9%(22/38) of patients were "good" at response to chemotherapy. Single factor analysis showed that:P16 positive patient’s median necrosis rate and chemotherapy response"good" rate were higher than P16 negative patients(P<0.01).Logisticregressionanalysisshowedthat:P16wasindependentpredictorofchemotherapyresponse(OR=43.50,95%CI2.64-708.90,P<0.01),therewasnocorrelationbetweenP16expressionandgender,age,tumortype,location.Conclusion The expression of P16 was significantly related to chemotherapy effect in osteosarcoma, it could be used as a marker to choice the patients in the need for chemotherapy before operation.

Osteosarcoma；Chemotherapy response;P16 protein

550007 贵阳，贵州省骨科医院关节科

2014-09-02)