灵芝孢子粉对百草枯中毒大鼠肺组织保护作用机制的研究*

赵爱华 周亚东 徐静 史继学 韩秋风 赵云来

(泰山医学院附属医院急诊医学科，山东泰安271000)

灵芝孢子粉对百草枯中毒大鼠肺组织保护作用机制的研究*

赵爱华 周亚东 徐静 史继学 韩秋风 赵云来

(泰山医学院附属医院急诊医学科，山东泰安271000)

目的通过观察灵芝孢子粉对百草枯中毒大鼠肺组织及血清氧化应激和炎症因子水的影响，探索其对肺损伤的保护作用。方法将72只(SD)大鼠随机分为正常对照组(A组)、百草枯模型组(B组)、灵芝孢子粉治疗组(C组)，B组和C组再分为1 h、6 h、24 h、72 h 4个亚组，每个亚组8只。A组给予生理盐水20 mg/kg一次性灌胃，B组和C组采用20％百草枯溶液20 mg/kg一次性灌胃，然后分别给予等容积的生理盐水、灵芝孢子粉150 mg/ kg/q12 h灌胃。按时间点取股动脉血清测定IL-6水平，处死后取肺组织，观察病理变化，采用ELISA法测定肺组织中TGF-β1和TNF-a含量;应用黄嘌呤氧化酶法测定血清SOD活力。结果B组、C组大鼠肺组织均出现大片出血、坏死，但C组大鼠肺组织损伤程度较B组显著减轻。与A组比较，B、C组肺组织1 h、6 h、24 h、72 h TGF-β1表达显著增加(P＜0 01)，但C组较B组为低(P＜0.05)。与A组比较，B组及C组肺组织中TNF-a、血浆IL-6从第6 h开始显著增加(均P＜O.01)，但C组在各时点均较B组为低(均P＜O.05)。C组在各时点的SOD活力均较B组为高(均P＜0.05)。结论灵芝孢子粉能减轻百草枯对大鼠肺组织的损伤，其机制可能与抑制TGF-β1的表达、降低肺组织TNF-a含量及血清lL-6水平、提高SOD的含量有关。

灵芝孢子粉;百草枯中毒;急性肺损伤;转化生长因子-β1;超氧化物歧化酶

百草枯是农业生产中重要的除草剂，对人畜毒性较大，百草枯可经皮肤黏膜、呼吸道、消化道进入体内，其中毒机制目前尚不清楚，因无特效解毒药，常规治疗效果差，临床病死率高达73.2％［1］。目前临床上主要以对症处理及血液净化治疗为主，暂无理想的治疗手段。因此寻找一种有效治疗百草枯中毒的方法甚为迫切。灵芝孢子是灵芝的生殖细胞，具有抗炎、抗缺氧、抗肿瘤、抗衰老及抗肝纤维化等作用。灵芝孢子粉能激活巨噬细胞的吞噬功能，增强非特异性免疫功能，提高体液免疫水平和细胞免疫水平［2］。但至今尚未见到有关灵芝孢子粉治疗百草枯中毒的相关文献，因此本研究采用动物实验的方法建立中毒模型，中毒大鼠肺组织TGF-β1和TNF-a的含量，血清IL-6水平、SOD的变化，探讨灵芝孢子粉对百草枯中毒大鼠急性肺损伤的保护作用及机制，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 材料

健康雄性SD大鼠72只，7周龄，体重180～200g，清洁级;由山东鲁抗医药股份有限公司实验动物中心提供，并在清洁级环境下采用标准颗粒饲料和标准饮用水按常规饲养。动物生产许可证号: scxK(鲁)2013-0001，动物使用许可证号:SYxK (鲁)2012-0005，并通过伦理审批。百草枯购于梯希爱(上海)化成工业发展有限公司，纯度＞98.0％;灵芝破壁孢子粉为山东宝来利来生物工程股份有限公司产品;TGF-β1、TNF-a和IL-6 ELISA试剂盒均为武汉博士德公司产品。SOD试剂盒为南京建成生物工程研究所产品。Infinite F200多功能酶标仪为瑞士TECAN公司提供。多功能真彩色细胞图像分析管理系统为OLYMPUS公司产品。

1.2 动物分组和模型制备

将实验大鼠随机分为3组:正常对照组(A组)、百草枯模型组(B组)、灵芝孢子粉治疗组(C组)，正常对照组8只;百草枯模型组32只(再分为4个亚组，分别为百草枯中毒后1、6、24、72h组，各8只);灵芝孢子粉治疗组32只(再分为4个亚组，分别为灵芝孢子粉治疗后1、6、24、72h组，各8只)。采用一次性灌胃百草枯溶液制备急性百草枯中毒肺损伤模型，灌胃剂量:百草枯(20％百草枯原液20 mg/kg)灌胃，C组予等容积百草枯灌胃;A组予等容积的0.9％氯化钠溶液灌胃。C组在百草枯灌胃中毒后即刻予灌胃灵芝孢子粉150 mg/kg，每隔12 h灌胃1次。B组及A组予灌胃相同剂量的0.9％氯化钠溶液，每隔12 h灌胃1次。

1.3 方法

1.3.1 标本采集与检测正常对照组在1 h后予10％水合氯醛0.5 ml/100 g麻醉，股动脉取血后处死大鼠;百草枯模型组和灵芝孢子粉治疗组分别在中毒后1、6、24、72 h予10％水合氯醛0.5 ml/100 g麻醉，股动脉取血后处死大鼠;3组大鼠均取右中上肺组织，将肺组织于-70℃冰箱中保存待测。

1.3.2 大鼠肺组织病理学观察检测结果将肺组织用4％甲醛固定，石蜡包埋，行苏木素-伊红(HE)染色，光镜下观察肺组织病理学变化。

1.3.3 IL-6水平、TGF-β1和TNF-a含量、SOD活力血清中IL-6水平测定常规分离获得血清，按试剂盒的说明书进行操作。TGF-β1和TNF-a含量测定常规取大鼠肺组织约0.5 g，加入1 ml预冷的0.9％氯化钠溶液研磨匀浆，离心后取上清液，按试剂盒的说明书进行操作。应用黄嘌呤氧化酶法测定血清中SOD水平测定常规分离获得血清，按试剂盒的说明书进行操作。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 一般表现

大鼠百草枯中毒后1h即开始出现精神萎靡不振，进食、进水量减少，反应迟钝、呼吸加快，6 h后出现口唇紫绀、张口呼吸，甚至呼吸窘迫等，24～72 h症状进行性加重，呼吸系统最为明显;灵芝孢子粉治疗组大鼠上述中毒表现有所减轻。百草枯模型组大鼠死亡16(50.00％)，灵芝孢子粉治疗组大鼠死亡7只(21.87％)，两组间差异有统计学意义(P＜0.05)。

2.2 肺组织病理改变

HE染色显示正常对照组大鼠肺泡结构清晰，肺泡壁薄，肺泡内未见水肿液，肺间质无炎性细胞浸润(图1A)。百草枯模型组1h出现明显毛细血管扩张、充血等肺泡炎症表现(图1B)，6 h后肺泡间隔明显增宽，肺泡腔内充满渗出的水肿液，部分有透明膜形成(图1C)，24～72 h肺组织炎症、渗出明显，伴有出血、坏死及炎性细胞浸润，肺泡结构紊乱，肺不张、肺气肿(图1D、E)灵芝孢子粉治疗组各时点肺组织病理改变与百草枯模型组相似，但病变程度相对较轻(图1F)。

图1 肺组织病理改变

2.3 各组大鼠肺组织TGF-β1的含量比较，与A组相比，随着时间的延长，各中毒组TGF-β1含量明显升高(P＜0.05);同时间点不同组别比较，B、C组各时间点TGF-β1含量明显高于A组(P＜0.05)，但C组较B组明显降低(P＜0.05)。

表1 各组大鼠肺组织TGF-β1含量比较

2.4 各组大鼠肺组织中TNF-a含量与正常对照组相比较，从第6h起百草枯模型组及灵芝孢子粉治疗组的肺组织匀浆中TNF-a含量显著增加，并且随着时间的延长而不断提高，在第72h达到最大值;灵芝孢子粉治疗组中TNF-a含量增加较百草枯模型组相对较少，与百草枯模型组的差异有统计学意义(P＜0.05)，详见表2。

表2 组大鼠肺组织中TNF-a含量的比较

2.5 各组大鼠血清中IL-6水平的比较，从第6h起B组和C组大鼠血清中的IL-6水平有显著增加，并随着时间的延长而不断增加;C组中IL-6水平增加相对较少，与B组相比差异有统计学意义(P＜0.05)，详见表3。

表3 组大鼠血清中中IL-6含量的比较

2.6 各组大鼠血清SOD水平的比较与正常对照组比较，从第6h起百草枯模型组和灵芝孢子粉治疗组大鼠血清中的SOD水平有显著降低，并随着时间的延长而不断降低，24小时降低之最低;灵芝孢子粉治疗组中SOD水平降低相对较少，与百草枯模型组相比差异有统计学意义(P＜0.05)，详见表4。

表4 组大鼠血清中SOD含量的比较(pg/ml)

3 讨论

关于PQ引起的急性肺损伤和肺纤维化的病理生理机制还未阐明，其中氧化应激、炎症反应、细胞凋亡均参与了PQ的病理损害过程［3-4］，其中对于肺损伤最主要机制是氧化-还原反应，百草枯通过肺泡上皮细胞和气管Clara细胞以主动转运的方式进行摄取进入肺内［5］，由还原型辅酶Ⅱ(NADPH)辅助的单电子还原为自由基，经超氧化物歧化酶(SOD)形成过氧化氢，进一步形成毒性更高的羟自由基(OH-)，大量的氧自由基产生，一方面直接使脂质、蛋白质及DNA等大分子物质发生氧化损伤破坏细胞膜及其细胞结构;另一方面通过刺激细胞因子和粘附分子的表达，介导炎症和免疫反应，导致及加重组织损伤，最终导致细胞死亡。因此，抑制氧化应激和炎症反应可能是治疗PQ中毒的重要策略。

灵芝是担子菌纲多孔菌科灵芝属真菌赤芝和紫芝的总称，具有扶正固本等功效，灵芝孢子是含有灵芝全部遗传活性物质的生殖细胞，其化学成分主要包括:蛋白质和氨基酸类、糖肽类、维生素类、同醇类、三萜类、脂肪酸类、内酯、无机元素和生物碱类等［6］。现代药理学研究证实，灵芝孢子粉具有免疫调节，抗毒、抗肿瘤、抗氧化、抗肝纤维化、抗突变、降血脂及中枢神经系统的双向调节作用［7-11］。灵芝孢子粉水提取物可抑制小鼠肌肉匀浆的自发性脂质过氧化和Fe2+/半胱胺酸引起的脂质过氧化，使丙二醛(MDA)生成量减少，并能抑制黄瞟呤氧化酶/黄嘌呤系统中超氧阴离子的生成［12］。本研究结果表明，灵芝孢子粉治疗百草枯中毒大鼠后，免疫组化显示肺组织TGF-β1上升幅度有所下降，TGF-β1基因表达量相对较小，差异有统计学意义，说明灵芝孢子粉能够减轻百草枯中毒大鼠肺损伤的程度。灵芝孢子粉作用机制较为复杂，从多种途径参与百草枯中毒肺损伤保护，而其中作用机制之一可能通过降低TGF-Jβ1的表达而发挥作用。灵芝孢子粉治疗组肺组织TNF-a含量及血清IL-6水平于中毒后各时间点较百草枯模型组均有显著降低，差异有统计学意义，提示灵芝孢子粉能减轻百草枯中毒大鼠肺脏的炎症损伤，可为临床治疗提供依据。另外，灵芝孢子粉治疗组SOD较模型组明显升高，说明灵芝孢子粉能减轻百草枯中毒大鼠肺脏的过氧化反应，从而减轻百草枯中毒大鼠的肺纤维化程度。

百草枯中毒治疗为临床治疗难题，而本研究发现TGF-β1、TNF-a、IL-6、SOD参与了百草枯中毒后肺损伤的病理生理过程，灵芝孢子粉能够有效抑制TGF-β1的表达，降低肺组织中TNF-a含量及血清IL-6水平，增加SOD水平，起到抑制氧化应激和炎症反应的作用，从而减轻百草枯中毒后大鼠肺组织的损伤程度，延缓肺纤维化的进程，本实验初步阐明了灵芝孢子粉治疗百草枯中毒肺损伤的可能机制，为临床治疗百草枯中毒提供了理论基础。但灵芝孢子粉药理作用非常复杂，临床用量缺乏科学的统一标准，有待于进一步研究。

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Protect effect of lingzhi spore on paraquat poisoned rat lung tissue and its mechanism

ZHAO Ai-hua ZHOU Ya-dong XU Jing SHI Ji-xue HAN Qiu-feng ZHAO Yun-lai
(Dept.of Emergency，Affiliated Hospital of Taishan Medical Universit，Taian 271000，China)

Objective:To investigate the effect of lingzhi spore on paraquat poisoned rats lung tissue and its mechanism .Methods:Seventy-two Sprague Dawley(SD)rats were randomly divided into normal control group(n=8)，paraquat model group(n=32)and lingzhi spore treatment group(n=32)Rats in model and treatment groups were administered with a single dose of PQ(20 mg/kg)by gavage，then 150 mg/kg lingzhi spore(treatment group)or 0.9％saline(model group) was administered by gavage.The rats in model and treatment groups were sacrificed at 1，6，24 and 72h，after treatment，the blood samples were taken from femore arterial and the lung tissue samples were also collected.The serum IL-6 levels were measured.and the pathological changes in lung tissue were examined:the expression of TGF-β1、TNF-a were detected by enzyme linked immune-osorbent assay，the SOD levels in lung tissue were also measured by xanthine oxidase method.Results:Severe hemorrhage and necrosis were noticed pathologically in lung tissue of mode group，the degree of lung injury in treated group was attenuated compared with model group.The expression on TGF-β1 in lung tissue of both model and treatment groups at1，6，24，72h increased significantly than the control group，but the expression in treatment group was lower than that in model group(P＜0.05)The TNF-a levels and IL-6 levels of model and treatment groups began to increase from 6h after poisoninq，but those in treatment group were lower at each time points(P＜0.05).SOD significantly decreased，but SOD in every point of treatment group were upon maturity of lingzhi spore only for high in the paraquat model group(P＜0.05).Conclusion:lingzhi spore can attenuate the lung tissue injury induced by paraquat in rats，which is associated with down-regulation of TGF-β1，TNF-a expression in lung tissue and decreased serum IL-6 lev-els，improve the content of SOD and there by reduce paraquat injury of lung tissue of rats.

lingzhi spore;paraquat poisoning;acute lung injury;transforming growth factor-β1;SOD

R965

A

1004-7115(2015)10-1085-04

10.3969/j.issn.1004-7115.2015.10.002

山东省自然科学基金(ZR2015PH044)。

赵爱华(1971—)，女，山东泰安人，副主任医师，本科，主要从事临床急诊科工作。

2015-8-12)