葫芦科作物未受精子房和胚珠离体培养研究进展

荣文娟　朱迎春　孙德玺　邓云　刘君璞

摘要：综述了影响葫芦科作物未受精子房和胚珠离体培养的因素，总结了培养获得植株的倍性鉴定和再生二倍体植株的纯合性鉴定方法，同时对单倍体植株的加倍方法进行简要概述，并提出葫芦科作物未受精子房和胚珠离体培养中存在的问题，为下步工作研究提供参考。

关键词：单倍体；加倍方法；葫芦科；未受精子房；胚珠；离体培养；倍性鉴定；纯合性鉴定

中图分类号：S336；S642.03 文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）02-0004-03

收稿日期：2014-04-09

基金项目：国家西甜瓜产业技术体系项目（编号：CARS-26-14）。

作者简介：荣文娟（1990—），女，河南周口人，硕士研究生，主要从事西瓜遗传育种研究。E-mail：rong90921@163.com。

通信作者：刘君璞，男，研究员，硕士生导师，主要从事西瓜遗传育种及栽培技术研究。E-mail：liujunpu@caas.cn。葫芦科作物包括多种瓜类蔬菜，广为人们喜爱且具有巨大的经济价值。西瓜、甜瓜（Cucumis melo）、黄瓜（C. sativus）、南瓜（C. moschata）等作物栽培面积逐年增大，但连作障碍和土传病害等影响了它们的产量和品质。而葫芦科作物遗传背景狭窄，常规育种周期长，不易获得目标性状，已很难满足育种要求。单倍体育种可以快速直接地筛选目标性状，拓宽种质资源，从而成为加快育种进程获得新品种的一种高效方法。植物离体雄核和雌核发育可以获得单倍体，但对葫芦科作物而言，通过花药和小孢子培养（雄核发育）获得单倍体的效率很低，诱导未受精的子房和胚珠（雌核发育）是目前流行的方法[1]。1921年，Blakesly首次在曼陀罗中发现了单倍体植株，此后单倍体就成为研究热点。葫芦科家族通过未受精子房和胚珠离体培养获得单倍体的研究也取得了很大进展（表1）[2-11]。目前，黄瓜的未受精子房培养已经建立了一套再生体系，单倍体培养获得的材料已经和育种实践相结合，并获得了20多个优良的育种材料[12-13]，但诱导频率却较低（20%）[14]。裴晓利通过离体诱导黄瓜雌核发育获得单倍体并构建了其DH群体的SSR标记图谱构建[15]；2013年孙守如等通过未受精胚珠培养使胚状体诱导率达到了31.1%，并对其胚胎发育途径进行了观察[11]。植物的离体雌核发育有愈伤组织和胚状体2条途径，陈学军等通过愈伤组织途径获得西葫芦再生植株[4]，谢冰等通过诱导胚状体途径产生再生植株[10，16]。周林等近年来对西瓜未受精子房或胚珠离体培养进行了初步研究，但是均未成功获得再生植株[17-18]。王建设等研究西瓜未授粉子房离体培养得到了单倍体植株并公开发明了其使用的专用培养基[19]。葫芦科作物未受精子房和胚珠离体培养获得的单倍体已经应用于实践，创造了生产价值，但是培养体中的影响因子众多，每个作物的培养体系还需要探索优化，提高诱导效率。

表1葫芦科作物未受精子房或胚珠离体培养的研究结果

作物外植体结果参考文献西葫芦子房愈伤组织[20]胚珠胚囊再生植株[5，10]子房单倍体[21-22]胚珠单倍体[4]胚珠单倍体，二倍体[23-24]子房异倍体，二倍体，混倍体[25]南瓜子房或胚珠胚状体[26]胚珠再生植株[11]黄瓜子房胚状体[21]子房再生植株[13，27]子房和胚珠单倍体，双单倍体[8]子房单倍体，双单倍体，混倍体[28]子房二倍体，单倍体，其他倍性[29]甜瓜子房再生植株[30]子房单倍体，二倍体，混倍体[7]西瓜子房单倍体[19，31]

1葫芦科未受精子房和胚珠离体培养的主要影响因素

葫芦科作物未受精子房或胚珠离体培养受供体植株的基因型、生长季节和胚囊发育状态、培养基、预处理方式、培养条件等因素影响。

1.1植株的基因型

植株基因型在培养过程中的差异已经在很多种作物中得到证实，不同基因型对作物产生的影响因作物不同而有差异[1，32]。Caglar等对27种不同的黄瓜母本进行了研究，结果证明，不同的基因型在辐射花粉诱导孤雌生殖产生单倍体的诱导率没有很大差异[33]。此后，Faris等用8种不同基因型的黄瓜进行试验，证明同一辐射剂量下的单倍体发生频率同基因型没有关系[34]。谢冰等研究西葫芦未受精胚珠离体培养结果表明，基因型较接种的胚胎发育时期和培养基组成对胚状体诱导率的影响较小[10]。裴晓利等研究了9种黄瓜子房切片对诱导培养基的反应，诱导率变化范围为65.52%～9333%[15]。同一品种的不同外植体需要的培养基也不一样，Shalaby等发现南瓜的子房和花药在同一培养基中的培养效果完全不一样[23]。在未受精子房和胚珠培养技术体系中，基因型的反应因不同的培养技术而不同，针对不同的基因型改良培养体系或许可以提高胚状体诱导率。

1.2生长季节和胚囊发育状态

适当的生长季节可给植株提供优良生长发育环境，植株可达到良好生理状态，胚囊也可有较好的发育状态。魏爱民等研究了植株栽培季节对黄瓜未受精子房离体培养的影响，结果表明，胚状体发生率和植株再生率在温度相对较高的6月下旬、7月上旬及9月明显高于其他季节，植株生长发育前期好于后期[35]。谢冰等在研究西葫芦未受精胚珠离体培养过程中发现不同品种秋播材料的诱导频率最高，且认为这可能与西葫芦是短日性植株有关[10]。很多研究者认为，成熟期或接近成熟的胚囊的细胞容易诱导孤雌生殖[36]。牛明明在未受精子房离体培养的试验中发现，外植体最佳取材时间是16：00—17：00，采取开花前一天的子房诱导率最高[37]。王朝阳认为，西葫芦植株开花当天和花前一天取胚囊的诱导率差异不明显[16]。孙守如等认为，雌花开放当天的胚囊已经发育成熟或接近成熟，出胚率最高[11，38]。Gémes-Juhúsz 等发现，黄瓜雌花开放前6 h的胚囊刚好成熟，胚的诱导率最高[28]。目前，成功诱导离体雌核发育的植物多数是接种胚囊单核期至接近成熟期的子房或胚珠，而接种大孢子发生时期的子房或过于幼嫩的子房则难以诱导雌核离体发育[5-6，11]。

在不同的季节，不同的葫芦科作物植株生理状态不一样，开花时间和胚囊发育也会不同，用开花时间来判断胚囊发育达到成熟状态进行观察验证[39]。

1.3培养基

通常未受精子房或胚珠培养技术研究中的培养基是研究者注重的部分。从子房或胚珠获得再生植株的程序一般是胚珠或子房在诱导培养基中诱导出胚状体，转接到再生培养基中使之成为植株；若在诱导培养基上长出愈伤组织，则还须在分化培养基上进一步分化出芽，再进一步诱导成为完整植株。研究者通常根据自己的需要调整培养基配方，以达到目的。培养基中除了基本培养基成分可调整外，往往还会通过添加激素、AgNO3、活性炭等进行组合分析。

有研究发现，基本培养基H和MS没有明显区别，大多数用的基本培养基为MS培养基或其改良型[40]。基本培养基中的蔗糖可以给外植体提供能量和维持一定的渗透压，一般认为3%～4%的蔗糖浓度适合未授粉子房的诱导[41]。在添加了40 g/L蔗糖的培养基中，西瓜未受精子房培养中愈伤组织诱导率最高[18]。陈学军等认为，培养基中不加任何外源激素不能诱导子房的膨大和雌核发育[4]。陈劲枫等研究了黄瓜子房培养在诱导培养基中添加0.04 mg/L 2，4-D使胚状体诱导率达72.7%[29]。李建欣等认为，不同浓度的6-BA和NAA对植株再生率的影响不同[42]。Malik等研究的甜瓜未受精子房[43]、刁卫平等研究的黄瓜未受精胚珠离体培养[44]结果都表明，适宜浓度的TDZ对胚胎形成有促进作用。孙守如等调整南瓜未受精胚珠培养诱导培养基并筛选了最佳组合，为MS+1.0 mg/L 2，4-D+0.25 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA，使用AgNO3对胚状体的形成有明显的抑制作用[11]。

1.4预处理方式

在接种作物的子房或胚珠时，一般要先进行预处理以提高出胚率。对预处理方式的研究主要集中在温度上[2]。Gemes-Juhúsz等在黄瓜未受精子房试验中发现，低温预处理使诱导率降低，而经过28 ℃或者35 ℃高温预处理的黄瓜出胚率和植株再生率比较高[28]。周林在进行西瓜子房培养时发现，4 ℃ 预处理72 h的诱导效果最好[17]。在南瓜、西葫芦未受精胚珠培养的研究中，很多研究者发现经过适宜时间的黑暗 35 ℃ 热激有利于胚状体的形成[10，15，42]。在水稻、小麦、辣椒和萝卜等作物的单倍体培养中，用甘露醇、秋水仙素和不同浓度蔗糖等进行预处理方式较多，可以进行尝试。

1.5培养条件

极大多数未受精子房或胚珠离体培养的研究中采用固体培养基[12-16]，Lotfi等在诱导甜瓜雌核发育时采用液体E20培养基培养，在培养黄瓜单倍体胚时也采用液体培养，这样便于检测单倍体胚[30]。一般胚状体和愈伤组织诱导和分化温度在 24～30 ℃之间，相对湿度为60%～80%，培养基的pH值以 5.8～6.0 为宜，在葫芦科作物中，前期暗培养约1周，后期采用恒温恒光的培养方式效果最佳[39]。对黄瓜未受精子房诱导的研究结果表明，25 ℃下黑暗预培养1 d能提高雌核发育的反应率[45]。在植物的组织培养中，有大量研究光质对组织培养中愈伤组织生长分化有影响；光质也影响大蒜、萝卜、辣椒、葡萄等愈伤组织诱导、增殖和分化[46]；在葫芦科作物未受精子房和胚珠的离体培养中，光质对胚状体的发生和植株再生的影响未见研究报道。

2植株的倍性鉴定和纯合性鉴定

通常通过未受精子房或胚珠离体培养得到植株的倍性不确定，根尖染色体观察、流式细胞仪测定、分子手段测定、细胞学观察及田间观察等方法可以鉴定再生植株的倍性[47]。根尖染色体计数是确定植株倍性最精确的一种方法，但对培养过程中自然加倍的植株无法鉴定其纯合性。流式细胞仪鉴定相对比较昂贵，对于二倍体和多倍体植株的纯合性依然无法鉴定。王璐等得到的再生植株经流式细胞仪鉴定为二倍体，之后通过田间性状观察比较初步鉴定为双单倍体植株[45]。对再生植株利用分子标记手段进行的鉴定迅速可靠。Diao等用SSR分子标记手段鉴定黄瓜子房培养获得的二倍体植株的纯合性，再生的二倍体植株中有51.5%鉴定为双单倍体植株[29]。苏敏等用EST-SSR鉴定西葫芦再生植株的倍性水平，并通过保卫细胞叶绿体计数法及流式细胞仪证实SSR标记分析的结果是可靠的[48]。研究者可以在可能的情况下，利用多种手段快速准确地确定再生植株的倍性水平。

3单倍体植株加倍

获得的再生单倍体植株加倍方法有自然加倍和人工加倍，其中自然加倍的频率受植株基因型影响[49]。葫芦科染色体人工加倍主要用秋水仙素处理[2，50-51]。Caglar等分析黄瓜单倍体染色体加倍，表明植株浸入0.5%秋水仙碱处理 4 h，达到60%的最高平均加倍效率[52]。Niemirowicz-Szezytt等的早期试验显示，须在试管中用0.1%秋水仙碱多次（3～5次）处理植株的分生组织尖才可获得比较好的加倍结果[50]。有研究以黄瓜单倍体再生植株的叶子作为外植体接种加倍，比用秋水仙碱处理更有效[53]。Faris等用单倍体植株的第1、第2张叶片为外植体直接再生出黄瓜的双单倍体系（DHs），因此再生组织的发展年龄可能是染色体加倍效率的重要影响因素[54]。

4存在问题及展望

葫芦科作物中的黄瓜、南瓜、甜瓜和西瓜种植范围广且有很高经济价值，人们对其品质和产量的需求也不断提高。传统育种方法培育新品种周期长且难以选到目标性状，单倍体育种和传统育种方法结合则能很快获得大量种质资源，直接选育新品种。雌核发育是通过诱导获得单倍体的一条途径，葫芦科作物黄瓜、南瓜、西葫芦、甜瓜通过未受精子房和胚珠离体培养也获得了单倍体植株。但是，目前的研究中还有两方面值得深入：第一，通过未受精子房和胚珠诱导单倍体成功获得再生植株的诱导率还不高，没有建立获得高胚状体发生率和植株再生率的完整培养体系；第二，关于雌核发育诱导机制的研究还处于空白状态，缺乏基因调控层面的研究，培养过程中引起细胞学变化和生理生化变化的研究也较少。未受精子房和胚珠离体培养的研究还处于初步阶段，随着以后研究的深入探索，能获得更多利用单倍体及其双单倍体系育种的信息，真正和育种工作相结合，提高育种效率，缩短育种年限。

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