植物内生木霉的鉴定及其抑菌活性

孙勇　蒋继宏　张海燕

摘要：对分离自健康植物的6种内生木霉菌进行活化，再观察菌落形态、颜色，测量生长速度，观察孢子形态，测量孢子直径范围，进而对供试菌株进行分类鉴定。结果初步鉴定，DBs0-13为多孢木霉（Trichoderma polysporum），DBs57为里氏木霉（T. reesei），DBs66为长孢木霉（T. longipile），40为绿色木霉（T. viride），171为康氏木霉（T. koningii），292为哈茨木霉（T. harizianum）。采用生长速率法测定供试真菌发酵液（相当于稀释10倍）对4种病原真菌的抑制效果。结果表明，6木霉菌对小麦赤霉菌、苹果轮纹菌、油菜菌核菌和可可球二孢菌都有不同程度的抑制作用，其中DBs0-13和171的抑菌率相对较高，并对4种病原真菌都具有抑制作用；6种木霉菌中抑菌率最高的是DBs0-13，其对油菜菌核病菌、可可球二孢的抑制率分别为62.89%、41.12%。

关键词：内生木霉菌；分类鉴定；形态特征；生长速率；病原菌；抑菌活性；生防菌

中图分类号： S432.4+4文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）02-0332-02

收稿日期：2014-04-11

基金项目：江苏省徐州师范大学校基金（编号：10XLA20）。

作者简介：孙勇（1977—），男，江西高安人，硕士，讲师，从事应用微生物学研究。E-mail：sunyong23@jsnu.edu.cn。

通信作者：蒋继宏，教授。E-mail：jhjiang@jsnu.edu.cn。植物内生菌是一定阶段或全部阶段生活于健康植物组织和器官内部的真菌或细菌，目前已成为生物防治中有潜力的微生物农药、增产菌或作为潜在生防载体菌而加以利用[1]。木霉属（Trichoderma）属于半知菌亚门丝孢纲丝孢目黏孢菌类[2]，分布比较广泛，是典型的土壤和木材腐生真菌。木霉菌是有效的生物农药资源，适应性广，生存能力强，对植物病原菌拮抗作用广谱，在防病的同时还能产生多种酶分解土壤中的植物残体、降解大分子化合物以便吸收利用，能与土壤中其他益菌协调生长、不污染环境等[3-5]。笔者在分离植物内生菌的过程中获得了几株植物内生木霉菌，鉴于木霉菌的生防特性，对分离到的内生木霉菌进行了分类鉴定和抗植物病原菌活性分析，为植物内生木霉菌的利用提供依据。

1材料与方法

1.1供试材料

1.1.1材料来源6株木霉供试真菌（DBs0-13、DBs57、DBs66、40、171、292）分离自健康植物组织中，为徐州师范大学药用植物重点实验室保藏菌种。

1.1.2抑菌试验用的病原真菌小麦赤霉病菌（Fusarium gramineaum Schwabe）、苹果轮纹病菌（Botryosphaeria berengriana f.sp. piricola）、油菜菌核病菌[Sclerotinia sclerotiorum （Lib.） de Bary]、可可球二孢菌（B. theobromae Pat.），均为徐州师范大学药用植物重点实验室保藏菌种。

1.1.3培养基马铃薯葡萄糖固体培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂粉20 g，水1 000 mL，pH值自然；马铃薯葡萄糖液体培养基（发酵用的培养基）：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，水1 000 mL，pH值自然。

1.2方法

1.2.1木霉菌的活化将冷藏菌种取出，在无菌条件下用接种环挑取供试菌的少量菌丝（或0.5 cm×0.5 cm的菌落）至含PDA培养基的平板中，于28 ℃培养箱中培养3 d。

1.2.2木霉菌株生长速度的测定将活化过的木霉菌落用打孔器打孔，获得的菌饼接于新培养基中，于28 ℃培养箱中培养3 d，采用十字交叉法测定菌落直径，计算出生长速度，同时观察菌落颜色、形状等。

1.2.3载玻片的培养将灭过菌的PDA培养基于微波炉中融化，待培养基温度降到40～45 ℃时于超净工作台中倒平皿，要倒得尽量薄（0.1～0.2 cm厚），待冷却。在上述培养皿中挑取大约0.5 cm×0.5 cm的培养基于灭过菌的载玻片上，然后挑取培养皿中菌种的菌丝于琼脂块的3个角上，再盖上灭过菌的盖玻片，用记号笔轻轻敲1下，以免盖玻片移动，在玻片上做好标记，于28 ℃培养箱中培养3 d左右（整个过程都要保证无菌状态）。

1.2.4显微特征观察取出培养3 d后的玻片，置于显微分析仪的操作台上，用针尖轻轻挑起盖玻片的一侧，慢慢地拿起盖玻片，并轻轻地挑掉周围的培养基，在新的载玻片中央滴1滴甲基蓝，盖玻片的一侧先接触液体，然后慢慢地放下盖玻片，用滤纸吸取周围多余液体，置于显微镜下观察，观察菌丝以及孢子并进行拍摄，同时使用测微尺测量孢子的大小（长和宽都要测）。每个菌株的孢子各测30个，记录数据。

1.2.5木霉菌发酵液（相当于稀释10倍）的制备于 500 mL 三角瓶中加入100 mL的PDA液体培养基，包扎，于高压灭菌锅中121 ℃灭菌25 min，无菌条件下用接种针挑取适量活化木霉菌株的菌丝，接种于三角瓶中的培养基中，置于28 ℃的摇床上150 r/min培养7 d，获得各菌株的发酵液，发酵液4 000 r/min离心5 min，取上清液，再在无菌状态下用022 μm滤膜过滤除菌，滤液分别装于灭菌锥形瓶中。

1.2.6抑菌效果的测定将PDA固体培养基加热至熔化，室温静置，待培养基温度降到60 ℃左右时，将木霉菌发酵液与培养基按照体积比1 ∶9充分混匀，混匀后立刻倒平板，在无菌操作台上室温放置至凝固，即制成含发酵液的平板，以不加发酵液的PDA平板为对照。从培养好的4种病原真菌菌落上，用灭过菌的打孔器沿边缘打出直径为0.4 cm的圆形菌块，将菌块分别转接至已凝固的培养基平板表面，并设3个重复，以无发酵液平板为对照，置于25 ℃培养箱下培养3 d。用十字交叉法测定菌落直径并记录数据，根据以下公式计算抑菌率：抑菌率=（对照菌落直径-发酵液处理后的菌落直径）/对照菌落直径×100%。endprint

2结果与分析

2.1木霉菌菌落形态和显微形态描述

供试木霉菌得菌落形态和孢子等特征见图1、表1，根据这些特征初步鉴定，DBs0-13为多孢木霉（T. polysporum）、DBs57为里氏木霉（T. reesei）、DBs66为长孢木霉（T. longipile）、40号为绿色木霉（T. viride）、171为康氏木霉（T. koningii）、292为哈茨木霉（T. harizianum）。表1木霉菌相关形态特征

2.2供试木霉对病原真菌的抑制作用

由表2可知，多孢木霉菌DBs0-13和171康氏木霉对4种病原真菌都有抑菌作用；其他4种木霉菌（DBs57、DBs66、40、292）除对小麦赤霉病菌没有抑制作用外，对其他病原菌也有较强的抑制作用。对小麦赤霉病菌抑制作用最强的是171；对苹果轮纹病菌抑制作用最强的是40，抑菌率为4885%；对油菜菌核病菌、可可球二孢菌抑制作用最强的是DBs0-13，抑菌率分别为62.89%、41.12%。综合抑菌结果可知，在所有供试木霉中DBs0-13的抑菌效果最好，是值得开发的生防菌。

3结论

6种内生木霉菌对苹果轮纹菌、油菜菌核菌和可可球二孢菌都有不同程度的抑制作用，而对小麦赤霉菌基本上不具有抑制作用（除了DBs0-13和171号木霉菌），与空白对照相比成负抑制状态，很有可能对小麦赤霉菌的生长反而具有促进作用。其中，DBs0-13具有比较高的抑菌率，而且其抑菌范围较宽，是比较好的生物农药资源，可以作田间试验以进一步开发利用。

参考文献：

[1]邹文欣，谭仁祥. 植物内生菌研究新进展[J]. 植物学报，2001，43（9）：881-892.

[2]孙勇，缪倩，孙颖，等. 6种植物中内生镰刀菌的分离和鉴定[J]. 江苏农业科学，2010（5）：437-439.

[3]李梅云，谭丽华，方敦煌，等. 哈茨木霉的培养及其对烟草疫霉生长的抑制研究[J]. 微生物学通报，2006，33（6）：79-83.

[4]王芊. 木霉菌在生物防治上的应用及拮抗机制[J]. 黑龙江农业科学，2000，42（1）：412-431.

[5]刘连妹. 绿色木霉HT01的生物学特性和抑菌特性[J]. 西北农业学报，2008，17（6）：179-183.唐梅，龚明福，罗燕，等. 抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌内生细菌KLXD06粗蛋白的提取[J]. 江苏农业科学，2015，43（2）：334-335.endprint