非小细胞肺癌中EGFR突变与雌激素受体表达的相关性研究＊

闫 明，王淑玲，赵 驰，陈小兵，李 印

（1.郑州大学附属肿瘤医院胸外科 450008；2.郑州大学基础医学院 450008；3.郑州大学第四附属医院病理科 450008；4.郑州大学附属肿瘤医院肿瘤内科 450008）

近年来世界各国肺癌的发病率和病死率都有明显升高的趋势，女性发病率增长速度尤其快，较多的证据显示雌激素及其受体（estrogen receptor，ER）可能起了重要作用[1]。针对女性表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）突变率高的分子靶向治疗即表皮生长因子酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKI），能使女性获益更多[2]。ER与EGFR突变在女性非小细胞肺癌（NSCLC）发生发展的作用与关系尚未完全清楚，本研究采用免疫组化法及实时荧光定量聚合酶链反应（TaqMan real time PCR）法分别检测ERα在NSCLC的表达及EGFR突变的情况，并分析其与肺癌临床病理的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集郑州大学附属肿瘤医院胸外科2010年7月至2012年6月手术切除并病理证实的NSCLC标本286例。术前均未作化疗、放疗。其中男194例，女92例，年龄34～75岁，平均65.2岁；病理诊断按照WHO 1999年肺癌组织学分类：鳞癌78例，腺癌208例。根据2009年国际抗癌联盟的肺癌临床分期标准（第7版）：Ⅰ期122例，Ⅱ期49例，Ⅲ期92例，Ⅳ期23例。另取20例癌旁正常组织作对照。

1.2 方法

1.2.1 ERα的检测 ERα检测试剂盒、SP试剂盒均购于福州迈新生物技术开发公司。免疫组织化学方法：将石蜡包埋的癌组织制成4～5μm切片，常规进行脱蜡，并浸入0.01mol／L、pH 6.0的枸橼酸盐缓冲液内20min。按照说明书用S-P法进行免疫组织化学染色。用已知的阳性切片作阳性对照，用PBS做阴性对照。结果判定：ERα以肿瘤细胞核或细胞质呈现棕黄色颗粒为阳性，阳性细胞总数大于25%为阳性。

1.2.2 EGFR基因突变检测 石蜡组织DNA提取采用TAKAKA试剂盒并按说明书步骤进行。首先将3～5片10μm的石蜡切片放于Eppendorf管中，加入DNA抽提液10滴并混匀，100℃加热10min，13 000r／min离心10min，吸取上清液直接用于Real-time PCR。EGFR基因突变实时荧光定量PCR法检测试剂盒由北京金菩嘉医疗科技有限公司提供，采用Taqman探针技术检测EGFR 19号外显子3种碱基缺失突变及21号外显子2种碱基置换突变。PCR反应体系包括：正反向引物、模板、MasterMix及Taqman标记探针。每次实验均设定阴、阳性对照孔及空白对照孔。反应循环参数为：50℃2min，95℃10min以激活DNA聚合酶。95℃15s，62℃1min，循环共40次。Real-time PCR仪为7900（Applied Biosystems，美国）。结果判读：以无模板对照扩增曲线的最高点为准设定阈值，没有出现扩增曲线或Ct＞38.0为阴性样本，出现扩增曲线且Ct≤34.0的样本为阳性样本，出现扩增曲线且34.0＜Ct≤38.0的样本需重复检测。

1.3 统计学处理 采用SPSS16.0统计学软件进行分析，计数资料用率表示，采用χ2检验，相关性分析采用等级变量Spearman相关分析，Logistic回归分析用于二分类变量的多因素相关分析，纳入变量的水准为单因素分析P＜0.2，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ERα的表达 ERα阳性部位定位于肿瘤细胞核或细胞质（图1），表达阳性率为36.0%（103／286）。其中在女性患者中的表达要显著高于男性患者（P＝0.004），肿瘤最大直径小于或等于3cm的患者显著高于肿瘤直径大于3cm的患者（P＜0.01），见表1。

图1 腺癌中ER的阳性表达SP法（HE×400）

2.2 EGFR基因突变 在286例标本中共检测到62例（21.7%）EGFR基因突变：29例（10.1%）为19号外显子碱基缺失突变；33例（11.5%）为2l号外显子碱基置换突变。在携带19号外显子碱基缺失突变的29位患者中，23例为E746-A750del突变，3例为L747-S752del突变，仅有2例为L747-A750del突变。在携带2l号外显子碱基置换突变的33位患者中，28例为L858R突变，5例为L861Q突变。本研究没有发现19号和2l号外显子同时突变的病例。EGFR基因突变和患者临床病病理之间的关系见表2。其中EGFR基因突变在女性、腺癌、肿瘤直径小于或等于3cm的患者显著增多（P＜0.01），在ERα表达阳性患者中显著高于ERα阴性者（P＜0.01）。经过单因素分析后，把P＜0.20的变量纳入到Logistic回归模型中进行多因素分析，结果显示女性（OR＝2.975；95%CI：1.550～5.721；P＝0.001）、ERα阳性表达（OR＝3.906；95%CI：1.996～7.692；P＜0.01）为EGFR基因突变的独立影响因素。由于鳞癌的标本中没有检测到EGFR基因的突变，所以没有把病理分型选进模型之中。

表1 ERα在非小细胞肺癌中的表达与临床特征的关系（n）

表2 EGFR突变与临床特征的关系（n）

续表2 EGFR突变与临床特征的关系（n）

3 讨论

肺癌的发病率和病死率高居各类恶性肿瘤之首，近几十年来女性肺癌发病率呈较快增长的趋势，男女患者病情发展及预后也不同[3]。尤为引人关注的是流行病学的一些改变：（1）肺腺癌的发病率显著升高，成为最常见的病理类型。（2）非吸烟者肺癌发病率上升，尤其是女性发生率明显上升，以腺癌为主。（3）女性肺癌发病率和病死率持续上升，已成为女性最主要的恶性肿瘤死因[4]。（4）晚期女性NSCLC患者较男性存在明显的生存优势。确切的原因仍不很清楚，但较多的证据显示性激素及其受体可能起了重要作用。

EGFR及其介导的信号转导是NSCLC发生、发展的重要因素[5]。最新研究发现，ER在EGFR的信号通路中发挥着重要的作用，与EGFR信号通路存在广泛的交叉调控[6]。EGFR介导的信号转导系统所引起的细胞效应包括细胞增殖、相互黏附、转移、抑制细胞凋亡及促进血管生成等多个方面。目前较为明确的主要有3条途径：（1）有丝分裂原活化蛋白激酶（Ras-RAF-MEK-MAPK）途径；（2）PI3K-AKT-mTOR途径；（3）JAK-STAT途径。导致EGFR通路持续激活的因素有很多，配体的不断产生、受体的高表达以及EGFR酪氨酸激酶的突变都可以使其持续处于激活状态[7]。基于EGFR基因激酶域基因突变理论研制的靶向药物治疗给NSCLC患者带来了新契机，抗EGFR的靶向治疗主要有两种：EGFR单克隆抗体和小分子EGFR酪氨酸激酶拮抗剂（TKI）。临床试验表明多种有EGFR突变的肿瘤对EGFR-TKI敏感，临床有效率10%～30%[5]。但是单一应用EGFR-TKI的较低的临床有效率及较高的继发性耐药仍无法解决[8]，因为单一靶点的治疗往往阻断不够完全，因此效果差；同时因为细胞内相关信号通路的交互作用，阻断其中一条通路又会导致其他通路的回馈性启动，进而诱导继发性耐药的发生。所以寻找多靶点阻断的联合用药是未来的发展方向，性激素受体所介导的信号通路可能成为肺癌潜在的治疗靶点。

雌激素的调控作用主要通过ERα来发挥作用。ERα在EGFR的信号传导通路中发挥着重要作用。Raso等[9]的研究显示NSCLC中ERα的阳性表达和EGFR突变存在正相关，与本研究结果相似。而Nose等[10]的研究则显示，EGFR突变和ERβ而不是ERα的阳性表达相关，并且在EGFR基因突变阳性的患者中ERβ的阳性表达预示着患者较长的无瘤生存时间。虽然本研究结果显示ERα与EGFR相关，但ERα是否在EGFR信号通路中起作用及如何作用，现在仍未完全明确。在肺癌的ERα信号通路中，雌激素与ER结合后主要通过非基因途径产生效应[11]。雌激素可以直接刺激NSCLC细胞核中雌激素反应基因的转录并且还可以刺激EGFR信号通路的传导。在雌激素刺激下NSCLC细胞株的EGFR配体会快速释放，从而激活EGFR及MAPK通路[11]。另外，雌激素可以使NSCLC细胞株的EGFR蛋白表达下降，而雌激素拮抗剂可以使EGFR蛋白表达升高[7]，这表明EGFR通路和ER通路之间可能存在一定的交叉互补关系。

多项研究结果表明，阻断或干扰ER信号的传导，都能抑制其介导的肿瘤发展：如芳香化酶抑制剂[12]，选择性雌激素受体调节剂[13]，选择性雌激素受体下调剂（氟维司群等）[11]。目前有多项临床实验正在进行中，以评估联合氟维司群和EGFR抑制剂对晚期NSCLC的临床价值。针对EGFR和ER两条信号通路的治疗Ⅱ期临床研究显示出良好的协同治疗效果[14]。

ER及EGFR信号通路的交叉调控能否解释女性肺腺癌发生发展的机制，EGFR-TKI的继发性耐药是否与ER通路的激活有关，这些都需要进一步的研究验证，希望本研究能为更深入理解肺癌发病分子机制、开发基于雌激素受体和EGFR的多靶点联合治疗药物提供一个思路。

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