丹参多酚对铁过载引起的脐血造血细胞氧化应激损伤的抑制作用

穆娟，赵明峰，李玉明，张宇辰，曹小立，李青(1 天津医科大学一中心临床学院，天津300070；天津市第一中心医院)

·论著·

丹参多酚对铁过载引起的脐血造血细胞氧化应激损伤的抑制作用

穆娟1,2，赵明峰2，李玉明2，张宇辰2，曹小立2，李青2(1 天津医科大学一中心临床学院，天津300070；2天津市第一中心医院)

摘要：目的探讨丹参多酚对铁过载引起的脐血造血细胞氧化应激损伤的保护作用。方法 分离脐血单个核细胞，分为对照组、模型组、丹参多酚低、中、高剂量组。模型组及丹参多酚低、中、高剂量组以400 μmol/L浓度的枸橼酸铁胺(FAC)建立铁过载细胞模型，丹参多酚低、中、高剂量组于培养第3天分别加入18、50、160 μg/mL丹参多酚培养24 h;对照组不加FAC及丹参多酚。采用流式细胞术检测各组细胞的活性氧(ROS)水平、细胞凋亡率，计数各组细胞集落形成数量。结果模型组ROS水平高于对照组及丹参多酚各剂量组(P均<0.05)。模型组细胞凋亡率高于对照组及丹参多酚高剂量组(P<0.05)。模型组红系祖细胞集落形成单位(CFU-E)、粒—单核系祖细胞集落形成单位(CFU-GM)、爆式红系祖细胞集落形成单位(BFU-E)和混合祖细胞集落形成单位(CFU-mix)数量均低于对照组及丹参多酚高剂量组(P均<0.05)。结论丹参多酚可减轻氧化应激引起的细胞凋亡及其对造血细胞增殖、分化功能的抑制作用。

关键词：丹参多酚；铁过载；氧化应激；细胞凋亡；造血干细胞；血液病

研究发现，铁过载可通过介导干祖细胞内活性氧(ROS)水平升高而抑制骨髓造血功能[1,2]。再生障碍性贫血、骨髓增生异常综合征、骨髓纤维化等血液系统疾病均可导致造血细胞内铁过载现象，主要由于长期贫血反复大量输血或原发病引起。丹参是一种活血化瘀中药，研究发现，丹参可通过抑制细胞内ROS从而抑制细胞凋亡，保护机体不受氧化损伤。丹参多酚是丹参的提取物。2013～2014年，我们将丹参多酚作用于铁过载的脐带血造血细胞，观察其对铁过载引起的细胞过氧化应激反应的抑制作用，探讨丹参多酚对造血细胞的保护作用。

1材料与方法

1.1材料与试剂新鲜脐带血来自本院产科健康足月分娩产妇，征得产妇及家属知情同意。丹参多酚酸盐购自上海绿谷制药有限公司，RPMI 1640培养液购自Gibco公司，枸橼酸铁胺(FAC)、胎牛血清(FBS)、钙荧光素乙酰氧基甲酯(Calcein-AM)、羟丙基纤维素均购自美国Sigma公司，甲基纤维素培养基MethoCult GF M3534购自Stem Cell公司，ROS购自碧云天生物技术研究所。Annexin Ⅴ-FITC流式细胞术检测试剂盒购自BD公司。

1.2实验方法

1.2.1脐带血单个核细胞(UC-MNCs)分离、培养及分组常规分离脐带血UC-MNCs，RPMI 1640培养液洗涤2遍后，采用完全培养基(含10%胎牛血清的1640培养液)悬浮。细胞以1×106/mL的密度种于12孔培养板中，于37 ℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养24 h。将UC-MNCs分为模型组、丹参多酚低、中、高剂量组及对照组，每组各3个复孔。

1.2.2铁过载细胞模型建立及鉴定模型组及丹参多酚低、中、高剂量组以FAC 400 μmol/L浓度建立铁过载细胞模型[3]，于培养第2天加入含400 μmol/L FAC的培养液，此后每24 h使用完全培养基换液，共在400 μmol/L FAC中培养48 h。收集模型组、对照组细胞，用RPMI 1640培养液洗涤2次，调整细胞密度为1×106/mL，加入Calcein-AM，终浓度为0.125 μmol/L，于37 ℃、5%CO2饱和湿度培养箱中孵育15 min，用PBS洗涤2次后，采用流式细胞仪检测各组细胞的平均荧光强度值，经测模型组、对照组铁过载荧光强度分别为45.20±8.30、78.21±9.47，模型组荧光强度低于对照组(P<0.05)，证实模型组铁过载细胞模型建立成功。

1.2.3细胞干预丹参多酚低、中、高剂量组于培养第3天分别加入18、50、160 μg/mL丹参多酚继续培养24 h。对照组不加FAC及丹参多酚，常规培养96 h。

1.2.4相关指标观察

1.2.4.1细胞内ROS水平各组细胞培养96 h后，调整细胞密度为1×106/mL，加入10 mmol/L的2′，7′-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)，使其终浓度为1 μmol/L，37 ℃避光温育20 min，用PBS洗涤3次，重悬于PBS中，流式细胞仪检测ROS水平。实验重复3次。

1.2.4.2细胞凋亡率各组细胞培养96 h后，按照试剂盒说明进行操作，调整脐血单个核细胞密度为1×106/mL。取细胞悬浮液100 μL于流式管中，加Annexin Ⅴ-FITC 5 μL和碘化丙啶10 μL，混匀后室温避光孵育15 min，上流式细胞仪检测细胞凋亡率。实验重复3次。

1.2.4.3细胞集落计数细胞培养96 h后，收集各组UC-MNCs，RPMI 1640培养液洗涤2次后重选细胞并计数。在24孔板中进行培养，每孔中甲基纤维素半固体培养基0.5 mL，加入各组MNCs 1×105个。在37 ℃、5%CO2培养箱中培养7～14 d,于显微镜下分别对红系祖细胞集落形成单位(CFU-E)、粒—单核系祖细胞集落形成单位(CFU-GM)、爆式红系祖细胞集落形成单位(BFU-E)和混合祖细胞集落形成单位(CFU-mix)进行计数。实验重复3次。

2结果

模型组ROS水平高于对照组及丹参多酚各剂量组(P均<0.05)。模型组细胞凋亡率高于对照组及丹参多酚高剂量组(P<0.05)。模型组细胞CFU-E、BFU-E、CFU-GM、CFU-mix集落数量均低于对照组及丹参多酚高剂量组(P均<0.05)。见表1。

±s)

注：与模型组比较，*P<0.05；与丹参多酚高剂量组比较，﹟P<0.05。 3讨论

铁过载是指由于体内铁过度沉积，导致重要脏器(尤其是肝脏、脾脏、心脏和胰腺等)的结构损害和功能障碍的病理现象，对骨髓造血及血液系统疾病也存在不良影响。铁过载常见于再生障碍性贫血、骨髓增生异常综合征、骨髓纤维化、地中海贫血等疾病。研究发现，铁过载可抑制骨髓的造血功能[4,5]，该抑制作用主要与激活细胞内的氧化应激反应有关[6,7]，即细胞内铁过载可诱导ROS升高，而ROS在细胞内过量聚集可直接、间接损伤造血干、祖细胞的数量、分化及功能，最终损伤骨髓造血功能。脐带血中含有丰富的造血干祖细胞。本研究发现，模型组ROS水平高于对照组，细胞凋亡率高于对照组，CFU-E、BFU-E、CFU-GM、CFU-mix集落数量均低于对照组，提示铁过载可激活细胞内的氧化应激反应，增高细胞ROS水平，从而造成细胞凋亡增加、集落细胞降低，考虑铁过载可能通过介导氧化应激反应损伤脐血来源的造血细胞增殖、分化功能。

研究发现，去铁及抗氧化治疗可逆转铁过载引起的骨髓造血功能损伤[3,6]。去铁治疗可使部分患者肝功能、胰岛功能部分甚至全部恢复，并使输血次数减少、间期延长、骨髓造血功能恢复[6,8]。目前临床去铁治疗的药物较少，去铁胺、去铁酮、地拉罗司三种药物虽具有确切的疗效，但均具有眼耳毒性、生长迟缓、骨骼改变、血细胞减少、肾功能衰竭等不良反应[9,10]，使用受到一定限制。中药对于血液系统疾病具有较为肯定的疗效，且不良反应少。丹参多酚是丹参的提取物，被广泛用于抗炎、增强机体免疫力、抗肿瘤、防治心脑血管疾病等。研究发现，丹参多酚是一种有效的抗氧化剂，能显著清除自由基，抑制由自由基引起的氧化损伤[11]。目前尚未有将丹参多酚应用于铁过载治疗的报道。本研究组前期研究发现，铁过载患者骨髓单个核细胞内ROS水平升高，通过祛铁治疗、抗氧化治疗后骨髓造血功能得到一定程度恢复[12～15]。有报道提示，丹参多酚可降低细胞内ROS水平，清除氧自由基，保护细胞功能[16]。本研究发现，模型组ROS水平高于丹参多酚各剂量组，提示应用丹参多酚后ROS水平降低，可能与丹参多酚减轻铁过载引起的氧化应激反应有关。本研究发现，模型组细胞凋亡率高于丹参多酚高剂量组，CFU-E、BFU-E、CFU-GM、CFU-mix集落数量均低于丹参多酚高剂量组，提示丹参多酚高剂量应用可明显减轻氧化应激引起的细胞凋亡及其对造血细胞增殖、分化功能的抑制作用，从而促进骨髓造血功能的恢复，推测丹参多酚需要达到较高剂量后方能发挥抗凋亡及促进集落形成作用。

综上所述， 丹参多酚可减轻铁过载氧化应激引起的细胞凋亡及对造血细胞增殖、分化功能的抑制作用，其作用机制可能与清除细胞内ROS、减少造血细胞凋亡有关。

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Inhibitory effect of salvianolate on iron overload-derived oxidative stress injury of

hematopoietic cells of umbilical cord blood

MUJuan1, ZHAO Ming-feng, LI Yu-ming, ZHANG Yu-chen, CAO Xiao-li, LI Qing

(1FirstCentralClinicalCollegeofTianjinMedicalUniversity,Tianjin300070,China)

Abstract:Objective To investigate the protective effect of salvianolate on the iron overload-derived oxidative stress injury of mononuclear cells of umbilical cord blood (UC-MNCs). MethodsThe UC-MNCs were divided into the control group, FAC group, low-dose salvianolate group, medium-dose salvianolate group, and high-dose salvianolate group. The control group received normal culture. The iron overload cell models in the FAC and salvianolate groups were established by adding 400 μmol/L FAC into the culture medium for 24 h on the second day. Then the low-dose, medium-dose and high-dose salvianolate groups were received 18, 50 and 160 μg/mL salvianolate for 24 h, respectively on the third day. Then the levels of reactive oxygen species (ROS), apoptosis rate and LIP level were detected by flow cytometry, respectively. ResultsThe ROS level of the FAC group was higher than that of the control, the low-dose, medium-dose and high-dose salvianolate groups (all P<0.05). The apoptosis rate in the FAC group was higher than that of the control group and high-dose salvianolate group(P<0.05). The counts of colony-forming unit-erythroid (CFU-E), granulocyte-macrophage colony-forming units (CFU-GM), erythropoietic burst-forming units (BFU-E) and mixed progenitor cell colony-forming units (CFU-mix) in the FAC group were significantly lower than those of the control group and high-dose salvianolate group (P<0.05). ConclusionsSalvianolate can reduce the oxidative stress caused by apoptosis and inhibition of proliferation and differentiation of hematopoietic cells.

Key words:salvianolate; iron overload; oxidative stress; apoptosis; hematopoietic stem cells; hematologic diseases

(收稿日期：2014-11-10)

通信作者简介：赵明峰(1971-)，男，博士后、博士生导师，研究方向为血液病的诊断与治疗。E-mail: zmfzmf@hotmail.com

作者简介：第一穆娟(1981-)，女，研究生在读，主治医师，研究方向为血液病的诊断与治疗。E-mail:mumu8135@163.com

基金项目：天津市自然科学基金资助项目(13JCYBJC23400)；天津市中医药管理局中西医结合基金资助项目(13120)；天津市卫生局科技基金重点资助项目(2011KR01)。

中图分类号：R551

文献标志码：A

文章编号：1002-266X(2015)10-0001-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.10.001