肝细胞癌组织中miR-21、miR-26a及miR-338的表达及意义

陈颖(天津市人民医院，天津300121)

·临床研究·

肝细胞癌组织中miR-21、miR-26a及miR-338的表达及意义

陈颖(天津市人民医院，天津300121)

摘要：目的探讨肝细胞癌组织中miR-21、miR-26a及miR-338在肝细胞癌发生发展中的作用。方法选择本院肿瘤中心组织标本库的肝细胞癌组织标本30例份(肝细胞癌组)及相应的癌旁组织标本30例份(对照组)，采用Real-time PCR法检测两组miR-21、miR-26a及miR-338的表达，分析其表达与肝细胞癌患者临床病理特征的关系。结果肝细胞癌组miR-21的表达高于对照组，miR-26a、miR-338表达均低于对照组(P均<0.01)。肝细胞癌组淋巴结转移、伴有肝硬化、高分化及TNM分期Ⅲ～Ⅳ期者miR-21相对表达量较高，淋巴结转移、不伴肝硬化、中低分化者miR-26a相对表达量较高，无淋巴结转移、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期者、有门静脉癌栓者miR-338相对表达量较高(P均<0.05)。miR-21的表达与肝硬化、瘤栓、肿瘤分化和TNM分期等呈正相关( P均<0.05)；miR-26a的表达与肝硬化和肿瘤分化呈负相关(P<0.05)；miR-338表达与肿瘤TNM分期和门静脉癌栓呈正相关(P均<0.05)。结论miR-21表达增高、miR-26a及miR-338表达降低可促进肝癌的发生及发展。

关键词：肝细胞癌；RNA，小分子干扰；淋巴结转移

多数肝细胞癌患者确诊时已为晚期，预后差[1]。微小RNA(microRNA，以下简称miRNA)是一类可负性调控基因表达的非蛋白编码的RNA家族，与肿瘤的发生、转移密切相关[5]。miRNA具有多种类型，可作为癌基因或抑癌基因在肿瘤的发生、发展中发挥重要作用。研究发现，多种miRNA在肝细胞癌中的表达异常[1,6]。2010～2014年，我们检测了30例份肝细胞癌组织标本中miR-21、miR-26a及miR-338的表达情况，探讨其在肝细胞癌发生、发展中的作用。

1材料与方法

1.1材料肝组织标本：选择本院肿瘤中心组织标本库的肝细胞癌组织标本30例份(肝癌组)及相应的癌旁组织标本30例份(对照组)。两组均有完整的临床病例资料，均经病理检查确诊。按国际妇产科协会的分类标准和世界卫生组织分级标准，Ⅰ期4例、Ⅱ期7例、Ⅲ期15例、Ⅳ期4例。患者年龄35～68岁、平均50岁，术前均未接受化学和放射治疗。试剂与仪器：Trizol购自Life Technologies公司；SYBR Green PCR Kit购自日本Toyobo公司；M-MLV Reverse TranscritaeKit购自美国ThermoFisher公司；miR-21、miR-26a、miR-338以及U6引物购自广州锐博生物科技有限公司；荧光定量PCR仪购自Stratagene公司；分光光度计(RS232C)购自德国Eppendorf公司。

1.2miR-21、miR-26a及miR-338表达检测采用Real-time PCR法检测两组miR-21、miR-26a及miR-338的相对表达量。常规Trizol试剂抽提组织总RNA，紫外分光光度计测定RNA 纯度和浓度。反转录反应体系为10 μL，包括5×反转录引物0.5 μL、100 mmol/L dNTP与dTTP混合物0.15 μL、反转录酶0.5 μL、5×反转录缓冲液2 μL、RNA抑制剂0.5 μL及RNA 1 μg。反应条件：42 ℃孵育60 min，70 ℃孵育5 min。PCR反应条件：95 ℃、1 min变性，95 ℃、 15 s，60 ℃、1 min，40个循环，以U6为内参照，分别进行数据分析，实验重复3次。实验结果采用定量PCR中的相对定量法进行分析，以2-△CT表示miR-21、miR-26a和miR-338的相对表达量，其中△Ct= miRNA目的基因平均Ct值-U6平均Ct值。

1.3miR-21、miR-26a及miR-338表达与临床病理特征的相关性分析肝细胞癌患者不同临床病理特征(包括性别、年龄、TNM分期、有无淋巴结转移、有无肝硬化、肿瘤分化程度、包膜是否完整、有无门静脉癌栓)与miR-21、miR-26a及miR-338相对表达量的相关性。

2结果

2.1miR-21、miR-26a及miR-338相对表达量肝癌组miR-21的表达高于对照组，miR-26a、miR-338的表达均低于对照组(P均<0.01)。见表1。

表1　两组miR-21、miR-26a及miR-338

注：与对照组比较，*P<0.05。

2.2miR-21、miR-26a及miR-338表达与临床病理特征的相关性①miR-21表达：淋巴结转移、伴有肝硬化、高分化及TNM分期Ⅲ～Ⅳ期者miR-21相对表达量分别高于无淋巴结转移、无肝硬化、中低分化及TNM分期Ⅰ～Ⅱ者(P均<0.05)；②miR-26a表达：淋巴结转移、不伴肝硬化、中低分化者miR-26a相对表达量分别高于无淋巴结转移、无肝硬化、高分化者(P均<0.05)；③miR-338表达：无淋巴结转移、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期者、有门静脉癌栓者miR-338相对表达量分别高于有淋巴结转移、TNM分期Ⅰ～Ⅱ、无门静脉癌栓者(P均<0.05)。miR-21的表达与肝硬化、瘤栓、肿瘤分化和TNM分期等呈正相关(r=0.675，P<0.05)，miR-26a的表达与肝硬化及肿瘤分化呈负相关(r=0.583，P<0.05)，miR-338表达与肿瘤TNM分期及门静脉癌栓呈正相关(r=0.627，P<0.05)。3种microRNAs与性别、年龄、包膜完整性均无明显相关性。见表2。

临床病理特征nmiR-21相对表达量PmiR-26a相对表达量PmiR-338相对表达量P性别0.3250.4640.367 男21443.1±2.1350.2±2.0281.4±1.2 女9409.2±1.3321.6±1.3234.6±3.0年龄(岁)0.6310.2460.548 ≤5017439.1±2.3378.3±2.4362.4±2.2 >5013426.4±2.0404.5±1.3358.8±2.3TNM分期0.0320.0590.042 Ⅰ～Ⅱ11361.0±2.4402.9±2.0408.2±2.5 Ⅲ～Ⅳ19450.9±2.2389.9±2.0459.1±1.6淋巴结转移0.0270.0150.008 有19551.2±2.0493.2±1.1321.3±2.1 无11412.7±2.0325.7±1.4465.4±4.0肝硬化0.0350.0410.211 有20491.8±2.2357.6±2.9389.8±2.0 无10390.1±1.1434.4±1.1431.2±2.2肿瘤分化0.0360.0460.056 高9488.2±2.0351.3±2.4411.4±2.3 中低21364.1±2.0473.2±3.0393.4±1.4包膜完整0.2210.3290.176 是8440.5±2.1401.8±2.7411.3±2.0 否22409.5±2.0449.2±3.0385.7±2.3门静脉癌栓0.0790.1730.040 有10420.2±2.1401.8±2.7483.9±1.2 无20400.2±2.0449.2±3.0349.4±1.6

3讨论

肝细胞癌最有效的方法是手术治疗，但术后复发和转移严重影响患者预后[2,3]。寻找肝癌特异性的分子标志物有助于肝癌的早期诊断。miRNA作为一种新的调节因子，不仅参与生物的生长和发育等生命过程，而且可作为癌基因或抑癌基因参与肿瘤的发生、发展，影响肿瘤患者的预后。miRNA可通过完全或不完全碱基配对与mRNA分子3′UTR端相结合，从而抑制靶基因的翻译，参与细胞增殖、细胞凋亡、肿瘤侵袭、转移等过程。

miR-21在多种肿瘤中均呈过表达，证实其在肿瘤形成过程中起广泛的致癌作用，具有促进癌细胞浸润和转移的功能。敲除肿瘤细胞中miR-21即可显著上调抑癌基因PTEN的表达水平，通过调控抑癌基因PTEN的表达，影响其下游的磷酸激酶及基质金属蛋白酶，从而影响肝癌的增殖、转移和侵袭。研究发现，miR-21表达与乳腺癌、胰腺癌、肺癌、胃癌、结直肠癌等有关，在恶性肿瘤的发病中发挥癌基因的作用[13]。miR-21在肝癌中的作用尚不明确。本研究肝癌组miR-21表达水平高于对照组，淋巴结转移、伴有肝硬化、高分化及TNM分期Ⅲ～Ⅳ期者miR-21表达水平较高，提示miR-21的表达与淋巴结转移、肝硬化、肿瘤分化及TNM分期有关。

miR-26a位于人类3号染色体上，在多种组织中均有表达。大量研究表明，miR-26a可抑制鼻咽癌、乳腺癌、肝癌细胞的增殖，但却可以促进胶质瘤细胞的增殖[14]。因此，miR-26a在不同类型肿瘤中的作用还存在一定的争议。研究发现，肝癌组织中miR-26a的表达水平降低。本研究肝癌组miR-26a表达水平低于对照组，有淋巴结转移、不伴肝硬化、中低分化者表达水平较高，提示miR-26a的表达与淋巴结转移、肝硬化及肿瘤分化有关，miR-26a在肝癌组织中的表达明显下调。

miR-338的异常表达与多种肿瘤的发生发展相关，可通过抑制肿瘤中促进增殖的基因表达从而加快分化进程，具有抑癌基因的作用[15]。miR-338在肝癌中的表达情况尚不明确。本研究发现，肝癌组miR-338表达水平低于对照组，无淋巴结转移、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期者、有门静脉癌栓者miR-338表达水平较高，提示miR-338的表达与淋巴结转移、肿瘤TNM分期及门静脉癌栓有关。

本研究表明，肝细胞癌组织中miR-21表达增高，miR-26a及miR-338表达降低，miR-21可能是肝细胞癌的致癌基因，miR-26a及miR-338可能是肝细胞癌的抑癌基因，且三种microRNA的表达与临床病理特征存在一定关系，microRNA可能作为肝癌诊断和预后指标提供依据。三种microRNA 可能互为靶点，相互作用，有待于进一步深入研究。

参考文献：

[1] Zhu Z, Zhang X, Wang G, et al.Role of microRNAs in hepatocellular carcinoma[J]. Hepat Mon, 2014,14(8):18672.

[2] Pugalenthi A, Cutter CS, Fong Y. Current treatment for small hepatocellular carcinoma: evolving roles for ablation and resection[J]. Adv Surg, 2014,48:97-114.

[3] Rich N, Singal AG. Hepatocellular carcinoma tumour markers: current role and expectations[J]. Best Pract Res Clin Gastroenterol, 2014,28(5):843-853.

[4] Bartels CL, Tsongalis GJ. MicroRNAs: novel biomarkers for human cancer[J]. Clin Chem, 2009,55(4):623-631.

[5] Li Z, Rana TM. Therapeutic targeting of microRNAs: current status and future challenges[J]. Nat Rev Drug Discov, 2014,13(8):622-638.

[6] Sun J, Lu H, Wang X, et al. MicroRNAs in hepatocellular carcinoma: regulation, function, and clinical implications[J]. Sci World J, 2013,2013:924206.

[7] Ma L, Teruya-Feldstein J, Weinberg RA. Tumour invasion and metastasis initiated by microRNA-10b in breast cancer[J]. Nature, 2007,449(7163):682-688.

[8] Huang Q, Gumireddy K, Schrier M, et al. The microRNAs miR-373 and miR-520c promote tumour invasion and metastasis[J]. Nat Cell Biol, 2008,10(2):202-210.

[9] Zha R, Guo W, Zhang Z,et al.Genome-wide screening identified that miR-134 acts as a metastasis suppressor by targeting integrin β1 in hepatocellular carcinoma[J]. PLoS One, 2014,9(2):e87665.

[10] Wang B, Li W, Liu H, et al. MiR-29b suppresses tumor growth and metastasis in colorectal cancer via downregulating Tiam1 expression and inhibiting epithelial-mesenchymal transition[J]. Cell Death Dis, 2014,5:1335.

[11] Chang BP, Wang DS, Xing JW, et al. MiR-200c inhibits metastasis of breast cancer cells by targeting HMGB1[J]. J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci, 2014,34(2):201-206.

[12] Sachdeva M, Mo YY. MicroRNA-145 suppresses cell invasion and metastasis by directly targeting mucin 1[J]. Cancer Res, 2010,70(1):378-387.

[13] Wang Y, Gao X, Wei F, et al. Diagnostic and prognostic value of circulating miR-21 for cancer: a systematic review and meta-analysis[J]. Gene, 2014,533(1):389-397.

[14] Yu L, Lu J, Zhang B, et al. MiR-26a inhibits invasion and metastasis of nasopharyngeal cancer by targeting EZH2[J]. Oncol Lett, 2013,5(4):1223-1228.

[15] Ebrahimi-Barough S, Massumi M, Kouchesfahani HM, et al. Derivation of pre-oligodendrocytes from human endometrial stromal cells by using overexpression of microRNA 338[J]. J Mol Neurosci, 2013,51(2):337-343.

(收稿日期：2014-11-13)

中图分类号：R735.7

文献标志码：B

文章编号：1002-266X(2015)10-0027-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.10.009