育成鸡新城疫病例的综合诊治及发病原因分析

冯莉莉，王月华

（山东省诸城市畜牧兽医管理局，山东 诸城262200）

本试验通过对新城疫疑似病例的发生背景及流行病学进行调查，临床症状及病理学变化详细观察，并进行病毒的分离、鉴定及序列分析，对本病例做出了确切诊断，并对发生原因进行了分析，报告如下。

1 发病情况

2013 年3 月，山东省泰安市某蛋鸡养殖场的40日龄育成鸡虽经弱毒苗和油乳剂灭活疫苗3 次免疫（分别是7 日龄ⅣH120 新城疫-传支二联疫苗1 倍量滴鼻，28 日龄ⅣH120 新城疫-传支二联疫苗2 倍量饮水，35 日龄注射新-支-流三联油苗注射免疫），10 000 只育成鸡突然发生以采食下降、精神沉郁、呼吸困难、排黄绿色便为主要特征的疾病。发病后第2 天开始死亡，死亡率迅速上升，高峰时每天死亡400 多只，死亡鸡只3 000 余只，死亡率超过30%。

2 临床诊断

本鸡群自40 日龄起，部分鸡出现精神委靡，病程较长的病鸡出现观星、扭脖、翅下垂、瘫痪等神经症状；羽毛蓬松，有明显呼吸道症状，病鸡呼噜、甩鼻、张嘴呼吸；食欲减退，嗉囊积液，排黄绿色稀粪，呈急性病程，高峰期日死亡达400 余只，死亡率超过20%。经调查该场305 日龄的产蛋鸡群2 周前曾出现过呼吸道症状，拉灰绿色稀粪，采食量下降，产蛋率下降20%左右，死亡30 余只。

3 病理变化

剖检见腺胃乳头及腺胃与肌胃交界处出血，十二指肠末端、空肠中部卵黄遗迹后4 cm 处，回肠起始部淋巴滤泡处黏膜肿胀、充血、出血、溃疡，盲肠扁桃体黏膜肿胀、充血、出血，直肠黏膜点状出血；气管黏膜附有黏液，黏膜充血。

4 实验室检验

4.1 病理组织学检查 肠黏膜上皮细胞坏死、脱落，黏膜固有层淋巴细胞浸润、充血，黏膜固有层淋巴滤泡处淋巴细胞坏死、崩解，眼观溃疡处黏膜发生出血性坏死，肌层出血，黏膜固有层水肿呈典型浆液性炎症。非溃疡处黏膜固有层也见明显充血、出血，淋巴细胞大量浸润；脾脏见淋巴细胞灶状坏死；部分病鸡脑膜充血、出血，血管周围淋巴细胞大量浸润，呈明显的血管袖套现象，并见明显的卫星现象、噬神经现象，小胶质细胞结节状增生。

4.2 病毒的分离和鉴定

4.2.1 病毒分离 将病料经尿囊腔接种9～12 日龄的鸡胚8 枚，0.2 mL/枚，37 ℃孵育，，弃去24 h 内死亡胚，无菌收取96 h 内的死胚和活胚尿囊液。第1代8枚中有6枚鸡胚在72 h出现死亡，致死率达75%，死亡鸡胚胚体出血、水肿。将收获的尿囊液按常规方法进行梯度倍比稀释，测定血凝活性，结果分离病毒对1%鸡红细胞的血凝效价为7Log2。

4.2.2 细胞病变观察（CEF 细胞接种） 制备鸡胚原代细胞。在无菌条件下采取9～11 日龄的鸡胚，至灭菌的平皿中，去除头、爪和内脏，并用眼科剪剪成1 mm3小块，用PBS 清洗，并静置几分钟，待组织块下沉，弃去上层洗液，再加洗液，如此反复冲洗3 遍后，弃去上清液。于沉淀组织块内加入2 mL 的0.25%胰酶，放入到37 ℃温箱中进行消化，每隔2 min 轻轻摇动1 次。取出后小心吸弃上层胰酶溶液，用PBS 轻洗2 次后加入些许5%生长液，用吸管将细胞团块吹打开。静置片刻，将上清液通过4 层纱布过滤。细胞计数，最终将细胞稀释成5×105个细胞/mL，取8 mL滤液于细胞瓶中。放入到37 ℃CO2培养箱中培养。分离出的病毒能在CEF 细胞上生长，引起典型的细胞病变。

4.2.3 病毒感染力的滴定（TCID50的测定） 按Reed和Muench 氏法计算：距离比例=（高于50%HA分数-50%）/（高于50%HA 分数-低于50%HA 分数）。

TCID50的对数=高于50%的病毒稀释度的对数+距离比例×稀释系数的对数。

距离比例=（100%-50%）/（100%-37.5%）=0.8

本试验高于50%的病毒稀释度的对数-4，距离比例为0.8，稀释系数的对数为-1，LgTCID50=-4+0.8×（-1）=-4.8，即TCID50=10-4.8/0.1 mL，即病毒作10-4.8稀释，每孔接种0.1 mL 能使半数细胞孔有细胞病变。

4.3 免疫学鉴定

4.3.1 抗体检测 对发病鸡群先后进行了2 次抗体检测，第1 次于发病后第3 天，第2 次于发病后第15 天。另外，还对该鸡场305 日龄的产蛋鸡群还进行了抗体检测，每次检测20 个样品。

表1 发病鸡群及产蛋鸡群新城疫抗体检测结果

从表1 可以看出，育成鸡鸡群发病刚开始时检测，新城疫抗体水平很低，平均效价为3.2 个滴度，2 以下的占25%；当发病后15 d 时检测抗体水平显著上升，平均效价达7 个滴度，为发病初的2.22 倍，7 个滴度以上的占60%，11 个高度以上的达10%，且抗体水平的离散度较大；产蛋鸡群抗体水平较高，平均效价为11 个滴度，10 个滴度以上的占80%，其中13个滴度以上的占25%，且抗体水平离散度较大。分析检测结果可知，育成鸡群因感染新城疫病毒，抗体水平迅速升高，出现较大离散度；而产蛋鸡群也属于新城疫感染鸡群，据调查发现本鸡群以前确实曾出现过呼吸道症状和产蛋下降现象。

4.3.2 血清中和试验 将分离毒株分别与EDS、ND、QJ（H5）、RE-4（H5）、RE-5（H5）、S2（H9）等6 种标准阳性血清等量混合，然后按照常规方法进行血凝试验。只有新城疫阳性血清能够完全中和分离病毒，而其他5 份阳性血清都不能中和本病毒，可初步判断为新城疫病毒感染。

4.4 病毒分子生物学鉴定

4.4.1 PCR 测定 根据GenBank 中ND 全基因组序列，设计合成引物。用提取的RNA 进行反转录：采用10 μL 反转录体系，反应体系及条件如下：70 ℃5 min，然后加入M-MLV，42 ℃30 min，95 ℃2 min。用制备的cDNA 进行PCR：采用50 μL PCR 体系，反应条件如下：经94 ℃5 min 变性，然后94 ℃30 s ，50 ℃30 s，72 ℃40 s，30 个循环扩增，72 ℃10 min 延伸。反应结束后，取5 μL PCR 产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。将PCR 扩增产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳，结果出现700 bp左右的一条亮带，与预期的目的片段大小一致。

4.4.2 遗传进化分析 将鉴定阳性的质粒送到博尚公司测序。并与GenBank中登录的NDV参考株基因进行序列比对，构建系统进化树。所用病毒GenBank登录号为：AY288987.1，AY288989.1，AY288993.1，AY288999.1，EU518677.1，EU518680.1，EU518681.1，EU518682.1，EU518683.1，EU518684.1，JN872181.1，JN942027.1，JN942028.1，JN942031.1，JN942032.1，JN942039.1，JN942040.1，JN967789.1，JQ697743.1，JQ697744.1，JX974435.1 等。本分离毒株与GenBank上登录的ND 参考毒株的同源性达到90%，说明此次疫情的是由新城疫感染病毒所致。本分离毒株与Newcastle disease virus isolate chicken/MX/NC04-635/2010（JQ697744.1）的同源性达到100%，属于同一分支。

5 发病原因分析

我国各类养鸡场都非常重视新城疫免疫，当前随着疫苗的广泛使用，新城疫在一定程度上得到了控制，免疫鸡群常见非典型新城疫发生，鸡群暴发典型新城疫的情况已比较少见，但该鸡群在已进行3 次免疫的情况下还是暴发了典型新城疫。究其原因，一方面可能源于鸡群免疫失败，另一方面则因在易感期感染了强毒新城疫病毒。发病3 d 时检测该鸡群新城疫抗体结果表明，免疫水平较低，2 个滴度以下的占25%，该鸡群发病后死亡率也是20%左右，这说明该鸡群暴发典型新城疫的最直接原因是新城疫免疫失败。

Patti J M 等研究表明，长期的免疫预防能导致NDV 的变异而产生强毒株，变异毒株与疫苗株在生物学特性、血清学和遗传学上有较大的差异，致使现有的NDV 疫苗免疫后不能形成有效地保护。在免疫选择压的作用下NDV 的毒力有增强的趋势，目前基因Ⅶ型d 亚型超强毒株在我国广为流行，即使经多次免疫的成年鸡群也难以抵挡住强毒新城疫病毒的侵袭，常发生非典型新城疫。

鉴于以上发病原因，建议从无免疫抑制病如传染性腔上囊病、鸡贫血、马立克病、白血病等种鸡场引进鸡苗；在免疫前后饮用电解多维以减少鸡群的应激反应。仅靠疫苗来消除ND强毒感染是不行的，要从根本上控制和消灭ND的发生,除选择适合的疫苗和制定合理的免疫程序外，更主要是采取综合性防疫措施，减少或消灭鸡群中的ND 强毒，阻止外界的ND 强毒进入鸡群，最终达到控制ND 的目的。