梗死后血管性认知障碍与血清胱抑素C 及APOE 基因多态性的关系

刘健伟，王 雁，隋爱华

VCI 是指由血管或血管的危险因素引起的认知功能障碍的一类综合征［1］，包括VCIND(血管性认知功能障碍非痴呆型)、VaD(血管性痴呆)和混合性痴呆(阿尔茨海默病和VaD)等不同程度及类型的认知障碍，其意义在于对早期认知功能下降患者的诊断及干预。随着我国老年人口的不断增加，血管性认知障碍的发病人数也越来越多，已有的研究表明APOEε4 基因与VCI 的发病相关。Chuo［2］曾报道血清胱抑素C 水平与认知功能存在联系，而目前胱抑素C 及APOE 基因多态性与VCI 的研究少见，为探索之间的关系，我们进行了以下的研究。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2013 年1 月-2014 年7月在我院神经内科住院的脑梗死患者218 例，均为山东汉族人，脑梗死入组的诊断均符合1995 年全国第四届脑血管病学术会议通过的诊断标准，经头部CT 或MRI 检查证实有梗死病灶。包括:(1)脑梗死后VCI 组110 例，其中男性58 例，女性52 例，入组者均符合DSM-IV 痴呆的诊断标准;MoCA 量表评分＜26 分，受教育年限＜12 y 的患者再加1 分;Hachinsk 缺血指数(HIS)≥7 分，HAMD 评分＜7分;所用量表评分分值均由至少2 名神经内科专科医师确认［3］;(2)脑梗死后认知功能正常组108 例，其中男性53 例，女性55 例，入选者无认知功能减退，MoCA 量表评分≥26 分，受教育年限＜12 y 的患者再加1 分。两组患者脑梗死严重程度、治疗时间、性别、年龄等一般情况差异无统计学意义(P＞0.05)，具有可比性。两组的排除标准:除外视、听、说障碍而不能配合检查者的患者;除脑梗死外其它脑部疾病或系统疾病所致认知障碍;患有严重心肝肾等重大疾病患者。

1.2 方 法

1.2.1 样本收集和处理 提取研究对象10 ml空腹静脉血分A、B 两管装，A 管聚丙烯EDTA 抗凝，按常规方法提取白细胞基因组DNA，-20 ℃低温保存;B 管离心分离血清，应用免疫比浊法在2 h 内测定Cys C 水平，正常参考值范围0.54～1.55 mg/L。

1.2.2 基因型检测 APOE 基因多态性检测，引物设计参照文献［4］，反应条件:95 ℃预变性3 min，95 ℃30 s，61 ℃30 s，72 ℃1 min，共35 个循环，72 ℃延伸5 min。

1.2.3 DNA 序列测定 将PCR 产物用5%琼脂糖凝胶电泳半小时后拍照观察结果，并将产物纯化，送至上海生工测序。

1.3 统计方法 所有数据应用SPSS17.0 统计软件进行处理，正态分布的计量资料以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用两个独立样本t 检验，组间计数资料比较采用χ2检验，Hardy-Weinberg 平衡检验观察样本是否具有群体代表性。

2 结果

2.1 一般资料的比较 两组人群性别、年龄匹配、高血压病史、糖尿病史、TG、TC、LDL、HDL、吸烟史、饮酒史组间相比差异无统计学意义(P＞0.05)(见表1)。

2.2 基因测序及分析 两组APOE 多态性位点基因型频率的分布均符合Hardy-Weinberg 平衡(P＞0.05)。APOE 经PCR 扩增后电泳，产生大小为227 bp 的片段(见图1)。APOE 第112 位点精氨酸与第158 位点半胱氨酸产生3 种等位基因ε2、ε3、ε4 和6 种基因型，ε2/2、ε3/3、ε4/4 3 种纯合子和ε2/3、ε2/4、ε3/4 3 种杂合子，测序图(见图2、图3)，112 位点与158 位点密码子序列(见表2)。

2.3 APOE 基因型及等位基因分布 VCI 组与CIND 组APOEε4 等位基因频率分别为21.4%和13.0%，VCIε4 基因携带组与CINDε4 基因携带组比较存在统计学差异(P=0.033)(见表3)。

2.4 胱抑素C 血清浓度分析及比较 VCI 组患者血清胱抑素浓度(1.11±0.27)mg/L 高于CIND 组血清浓度(0.97±0.33)mg/L，经统计学检验有意义(P=0.012);而VCIε4 基因非携带组患者血清胱抑素浓度(1.07±0.29)mg/L 虽略高于CIND 组，但仍存在统计学差异(P=0.026);VCI 组中ε4 基因携带组血清浓度(1.24±0.23)mg/L 明显高于ε4 基因非携带，且两者的差异有统计学意义(P=0.035)(见表4)。

表1 两组一般资料的比较

表2 不同基因型112、158 位密码子序列

表3 两组APOE 基因型及等位基因频率分布

图1 APOE 基因PCR 扩增图Marker 大小为600 bp

图2 APOE158 位点测序图

图3 APOE112 位点测序图

表4 各组血清抑素C 水平比较

3 讨论

VCI 是指由血管或血管相关因素引起的认知功能障碍［5］，因对VCI 进行早期干预可以延缓病程进展，故对其发病机制及影响因素的研究越来越多［6］。目前除了血管损害，遗传因素也逐渐重视起来。ApoEε4 基因、notch3 基因是目前已被证实的VCI 潜在的致病基因。我们的研究发现VCI 组APOEε4 等位基因频率高于对照组，并存在统计学差异，与前述结论较为一致，提示在山东汉族人群中，APOEε4 基因携带可能增加VCI 的发病风险。胱抑素C 又称半胱氨酸蛋白酶抑制剂C，是一种低分子量的非糖基化碱性蛋白质，广泛存在于体液及各种组织的有核细胞中，参与细胞内外蛋白水解酶的调控，保护细胞免受不适当的内源性或外源性蛋白酶水解，是目前发现对组织蛋白酶B 抑制作用最强的物质［7］。自1961 年Clausen 从脑脊液中首次发现后，研究者对胱抑素C 的生物学作用逐渐重视起来。新近有报道称血清高胱抑素C 水平可能是阿尔茨海默病和轻度认知障碍的危险因素［8］。Levy E 的研究也证实，胱抑素C 基因68 位点处发生基因突变(A/G)与遗传性淀粉样血管病(HCCAA)的发病相关［9］。Yaffe［10］等认为血清CysC 水平可作为反映老年人认知功能的标志物之一，国内罗镧等［11］报道称糖尿病患者的血清CysC 水平能增加2 型糖尿病患者轻度认知功能损害，王大力［12］也曾报道称血清胱抑素C 水平升高是梗死后VCI 的危险因素。这些研究报道从各方面说明了胱抑素C 与认知障碍具有相关性。有研究表明胱抑素C 对脑梗死的发病具有保护作用［13］，但更多的研究更倾向胱抑素C 与脑梗死的发病相关［14］，并提出血清胱抑素C 可能是脑梗死的独立危险因素的观点，而脑梗死是VCI 最主要的血管影响因素。我们将实验研究对象定为梗死后VCI 人群，发现梗死后VCI 组患者血清胱抑素C 浓度高于对照组且两组的差异有统计学意义，提示山东汉族人血清胱抑素C 水平可作为提示梗死后VCI 早期发病的临床检测指标之一。

近年研究表明，血清胱抑素C 的表达失衡是动脉粥样硬化发生、发展的重要原因之一，而动脉粥样硬化可通过多种机制作用增加认知障碍的发病风险［15］。人类ApoEε4 等位基因能增加胆固醇含量，促进动脉粥样硬化形成，引起脑组织缺血、缺氧坏死，导致VCI 的发生。据上可知，胱抑素C 与APOEε4 基因两者均能通过促进动脉粥样硬化的发病来增加VCI 的风险。我们对VCI 组APOEε4 基因携带者与APOEε4 基因非携者进行对比，发现VCI伴APOEε4 基因携带者血清胱抑素C 浓度明显高于VCI 组APOEε4 基因非携者，且两者的差异有统计学意义，说明血清胱抑素C 水平升高可提示梗死后VCI 伴APOEε4 基因携的患者有早期发病的风险，胱抑素C 水平的检测可为梗死后VCI 患者的临床早期诊断提供依据。

据上可以得出，血清中胱抑素C 水平增高，尤其APOEε4 基因携带患者的血清胱抑素C 水平的增高可以作为梗死后VCI 的早期诊断依据。但本研究病例数较少，且未对胱抑素C 水平的影响因素进行分析，有待进一步扩大样本量进行多中心联合研究，进一步明确具体机制，为早期干预VCI 的发生创造条件。

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