银杏内酯和白果内酯对大鼠脑缺血再灌注损伤后VEGF 的表达的影响

刘秀萍，邓 方

缺血性脑血管病主要是由于血管病变引起血流中断或减少，导致相应血管供应区缺血缺氧而发生一系列病理生理反应。而促进损伤区域局部血管再生，建立良好的侧支循环是缺血后重要的代偿机制［1］。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)于1989 年由Ferara 等在牛垂体滤泡星形胶质细胞体外培养液中分离纯化，是胚胎期血管新生和血管形成的关键调节物。VEGF 及其受体(vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR)系统，在缺血性脑血管病的微循环重建过程中起着至关重要的作用，可能是脑缺血后血管新生调控的中心环节［2］。银杏内酯(ginkgolides，GK)和白果内酯(bilobalide，BB)是银杏叶制剂中最为有效的成份，但其对于脑缺血后血管生成方面却鲜有文献报道。为深入研究其对急性脑缺血再灌注损伤的作用机制，本研究从血管新生角度，观察了GK 和BB 对脑缺血的保护作用及对缺血侧皮质VEGF 和VEGER-1 表达的影响。

1 材料和方法

1.1 实验动物 清洁级雄性Wistar 大鼠，体重260～280g，吉林大学实验动物中心提供，实验动物生产许可证号:SCXK(吉)2013-0001。

1.2 药物与试剂 GK(四川成都百裕公司提供，批号:20130801)和白果内酯(四川成都百裕公司提供，批号:NZ130609)，兔抗大鼠VEGF 抗体，VEGFR-1 抗体，β-actin，羊抗兔二抗，免疫组化试剂盒(PV-6000，GBI)，BCA 蛋白定量试剂盒，浓缩型DAB 试剂盒、ECL 显影液。

1.3 实验分组 将实验动物随机分为假手术组(Sham 组)、MCAO+盐水对照组(Saline 组)、MCAO+GK 组(10 mg/kg，GK 组)、MCAO+BB 组(10 mg/kg，BB 组)，每组6 只。每组动物于脑缺血再灌注前30 min 腹腔给药，假手术组和盐水对照组给予等量生理盐水。

1.4 大鼠脑缺血再灌注模型的制备 参照Zea Longa 改良线栓法制备大鼠大脑中动脉闭塞模型(middle cerebral artery occlusion，MCAO)。具体方法为:以10%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，仰卧位固定，碘伏消毒，经颈部正中切口暴露颈动脉三角。手术分离左侧颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉，结扎颈外动脉和颈总动脉，在颈外动脉近分叉处剪一“V”字形切口，将直径为0.26 mm、赖氨酸包被的钝性鱼线线栓斜行插入，通过颈内动脉推进到大脑中动脉，插入约18～20 mm 遇有阻力时为止。缝合肌肉和皮肤，术中保持大鼠肛温在37 ℃±0.5 ℃Sham 组不插线栓，余操作相同。

1.5 神经功能评分、脑梗死体积测定 按Zea Longa 5 分制评分法对大鼠进行评分。评分标准:0分:无神经功能损伤症状;1 分:对侧前爪不能完全伸展;2 分:向右侧转圈;3 分:向右侧倾倒;4 分:不能自发行走，意识丧失。入组标准为:评分为1～3分，且无蛛网膜下腔出血。大鼠脑缺血2 h 再灌注12 h 后，麻醉后迅速取脑，于-20 ℃冰箱中速冻18 min，然后将脑组织放入脑槽中，沿脑组织冠状切面切成5 片，随后将脑片放入2%TTC 溶液中，37 ℃避光置水浴箱30 min。再将脑片置于4%多聚甲醛溶液固定4～6 h 后，数码相机拍照，应用图像分析软件计算脑片梗死面积。

1.6 脑组织病理组织学检查 大鼠脑缺血2 h再灌注12 h 后，用10%水合氯醛麻醉，迅速开胸，用生理盐水冲洗心脏，然后用4%多聚甲醛灌注固定，断头取脑，置于相同灌注液，4 ℃后固定1 w，依次脱水透明浸蜡及包埋，常规HE 染色封片，光镜下观察。

1.7 免疫组织化学法检测VEGF 及VEGFR-1的表达 取大鼠脑组织冰冻切片，严格按照免疫组化试剂盒说明书操作，3% H2O2室温孵育，滴加一抗(兔抗VEGF、VEGFR-1，工作浓度分别均为1∶200)后滴加二抗，经蒸馏水冲洗、苏木素复染、盐酸酒精分化、乙醇梯度脱水、二甲苯透明、中性树胶封片，显微镜下观察。阳性细胞计数:在400 倍光学显微镜下分别随机选取5 个视野，计数免疫反应阳性细胞数后取平均值。

1.8 Western blot 检测VEGF 及VEGFR-1 的表达 取缺血侧大脑皮质进行蛋白提取，BCA 法测定蛋白浓度。蛋白变性后行SDS-PAGE 电泳、转膜封闭，分别加入一抗(VEGF，1∶1000;VEGFR-1 抗体，1∶1000;β-actin，1∶2000)，4 ℃孵育过夜。辣根过氧化物酶标记羊抗兔二抗(1∶2000)室温孵育，ECL液显色，凝胶成像系统显影。采用Image J 图像分析测定Western blot 条带灰度值，结果以VEGF 及VEGFR1 与β-actin 灰度值的比值显示。

2 结果

2.1 GK 和BB 对脑缺血/再灌注大鼠脑梗死范围及神经功能缺损的影响 TTC 染色结果提示:假手术组脑组织未见梗死灶，Saline 组脑组织梗死面积百分比为(41.09±1.33);与Saline 组相比，GK 组和BB 组脑梗死范围减小(梗死面积百分比分别为23.8±0.58 和26.97±0.73)(P＜0.01)，提示GK 和BB 对缺血/再灌注脑损伤有确切的保护作用。在神经功能损伤方面，假手术组无神经系统损害症状，Saline 组均出现明显的神经功能缺陷表现，GK 组和BB组则明显改善大鼠神经症状(P＜0.01，P＜0.05)。提示GK 和BB 对大鼠神经功能损伤有明显的改善作用(见表1、图1)。

2.2 VEGF 及VEGFR-1 蛋白的表达变化VEGF 蛋白含量明显下降，差异有统计学意义(P＜0.01)。在GK 和BB 组，VEGF 蛋白表达较缺血再灌注组显著增多，差异有统计学意义(P＜0.01)。VEGFR-1 蛋白的表达在各组间表达量基本相同，无统计学差异(见图2)。

2.3 组织形态学表现 组织切片经HE 染色，于400×光镜下观察。Sham 组未见明显病理改变，各种神经细胞层次清晰，细胞数量、形态多样化，胞核界限清晰，胞质均匀，可清晰见到细胞核。Saline组见大鼠脑缺血中心区大量神经元变性坏死，细胞排列紊乱，形态不规则，可见部分神经元胞质浓缩，胞核固缩、碎裂或溶解。GK 和BB 组与Saline 组相比，梗死区缩小，神经元损伤程度减轻，细胞排列尚规则，残存的细胞形态相对正常，GK 组残留的神经元细胞数较BB 组稍多(见图3)。

2.4 VEGF 及VEGFR-1 阳性细胞的表达变化组织切片经免疫组化染色，于400×光镜下观察。Sham 组可见少量VEGF 及VEGFR-1 表达阳性细胞，分布于在脉络丛及软膜等处。缺血2 h/再灌注12 h 后，基底节处缺血病灶区可见VEGF 及VEGFR-1 免疫阳性神经细胞数量明显增加，主要分布在缺血病灶周边的神经元、胶质细胞、血管内皮细胞等。阳性细胞胞浆内呈明显棕黄色着色。GK 组和BB 组较Saline 组阳性表达部位相似，阳性表达率较Saline 组显著增高(见图4)。

表1 各组再灌注12 h 神经功能评分、脑梗死体积百分比比较(±s，n=6)

表1 各组再灌注12 h 神经功能评分、脑梗死体积百分比比较(±s，n=6)

与假手术组比较#P＜0.01;与盐水对照组比较* P＜0.05，＊＊P＜0.01

图1 大鼠脑缺血再灌注12 h 后神经功能评分(A);脑梗死体积(B)

图2 大鼠再灌注12 h Western blot 示VEGF、VEGFR-1 蛋白水平的表达

3 讨论

本研究采用线栓法制备大鼠脑缺血/再灌注模型，从血管新生角度观察了GK 和BB 的神经保护作用。结果显示:GK 和BB 能明显改善缺血/再灌注后大鼠神经功能缺损症状，减小脑梗死范围，减轻组织形态学改变。此前的研究证明，受损的脑组织可出现再塑性，神经元发生的机制均与血管再通有重要的相关性，所以血管生成可以为大脑修复提供新的思路［3，4］。VEGF 是内皮细胞的有丝分裂原，具有促进内皮细胞增殖、加速新生血管形成、提高血管通透性等生物学特性，有类似于血管源性的神经保护和神经营养作用。在脑缺血发生后，VEGF 能诱导新生血管形成，并使新生血管从正常组织向半暗带及缺血中心区延伸，增加受累脑组织再灌注及供氧量，从而减轻脑缺血损伤。有研究发现，VEGF 参与了局部梗死周边区的微血管形成作用和血液供应的改善［5］。VEGF 还可间接地促进神经细胞再生并抑制细胞凋亡［6，7］。目前己经证实，缺血及移植损伤能显著上调神经元及星状细胞VEGF 的表达。在多种生理和病理情况下以旁分泌的形式作用于血管内皮细胞上的受体，产生不同的生物作用，包括:(1)诱导内皮细胞增殖、分化和迁移，以及体内血管的生成;(2)增加血管通透性;(3)促进血管支持物的生成等［8］。VEGFR-1 主要位于血管内皮细胞上，其胞外部分对VEGF 具有很高的亲和力，能以可溶形式存在［9］。VEGF 主要通过VEGFR-1在内皮细胞上发挥作用［9］，促进内皮细胞增殖、迁移、微血管管型结构形成及成熟血管生成［10］。

本研究免疫组化及Western blot 结果证明，大鼠缺血再灌注损伤后，缺血侧皮质区VEGF 的表达明显提高，这可能是机体对抗缺血缺氧所致脑组织损害的一种自身保护方式。而GK 和BB 能刺激机体VEGF 分子表达上调，从而增强其诱导血管生成的功能，促进了新生血管的形成和侧支循环的重建，进而增加局部脑血流量，提高脑组织对葡萄糖和氧的摄取，加快神经功能缺损的恢复并有效缩小脑梗死的最终体积。免疫组化结果显示，在GK 组和BB 组中，VEGFR-1 的阳性细胞数较Saline 组明显增多，表明GK 和BB 在促进VEGF 表达的同时还能通过促进其受体的表达进一步增强缺血区血管生成。然而遗憾的是，Western blot 结果显示不同组VEGFR-1 的表达量没有明显的差异。对这一结果，分析可能有以下几方面的原因:首先，本研究选取的时间点为缺血2 h/再灌注12 h，可能GK 和BB 促进VEGFR-1的表达上调的作用通过半定量的Western blot 还没有充分显现，延长观察时间可能会发现其上调趋势;其次，虽然给药后免疫组化证实了表达VEGFR-1 的阳性细胞数增多，但是单个神经元表达的VEGFR-1的量较小，其蛋白总量变化较小，提高检测手段的灵敏度可能有助于检出其变化情况;第三，VEGFR 存在两种亚型，GK 和BB 可能对VEGFR-1 和VEGFR-2 均有作用，但可能对VEGFR-2 的影响更大，因此选用针对亚型的抗体可能更好地揭示其变化规律，尚需进一步证实。但从以上实验结果，仍可证实GK 和BB 确实可以通过促进血管生成发挥对脑缺血再灌注损伤的神经保护作用。银杏叶制剂已广泛应用于缺血性脑血管病的临床治疗，针对其应用价值和作用机制已进行了很多研究，证明了银杏内酯和白果内酯具有抗炎、抗凋亡等作用［11，12］。但此前研究所用的银杏叶制剂多为混合成份，未能分辨其不同成份间的作用差异，机制探讨难于深入。本研究选用了单一成份的银杏内酯和白果内酯进行研究，并比较了两者的作用差异。从血管新生的角度，本研究证实了两者可有效促进血管生成，且银杏内酯组具有更显著的变化趋势。在随后的研究中我们将进一步深入探讨。

本研究证实，银杏内酯和白果内酯可以通过激活血管内皮生长因子上调，进而促进新生血管形成，在脑梗死再灌注损伤中发挥神经保护作用，这可能为脑梗死患者的治疗和预防提供新的靶点。

图3 大鼠脑缺血再灌注12 h 各组大鼠HE 染色(HE×400)

图4 大鼠缺血再灌注12 h 后免疫细胞化学染色VEGF、VEGFR-1 的表达(×400)

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