APP/PS1 小鼠脑内Aβ 水平与认知行为学增龄性变化的研究概述

高堂珂综述，薛卫国审校

APPswe/PS1dE9 双转基因小鼠是目前阿尔茨海默氏病(Alzheimer’s disease，AD)病理学实验中常用的动物模型，该模型是Jankowsky 实验室以AD 病理学理论中Aβ 级联致病假说为基础［1］，培育出能够表达人类APP 和PS1 突变基因的转基因鼠动物模型［2］，该模型可在一定程度上模拟AD 的病理特征和渐进性的病程。近年来，许多使用APPswe/PS1dE9双转基因小鼠的实验中发现，小鼠脑内Aβ 沉积量与其认知功能减退并不成正比，小鼠脑内Aβ 沉积量与其月龄变化关系也没有较为统一的结论。因此实验中往往需通过认知行为学数据及Aβ 水平干预措施对进行评价，再进行综合分析，这样产生的误差会影响实验结果。故本文将结合目前的研究文献对该双转基因鼠表型中的Aβ 病理与行为学是否存在可能的相关性及二者与小鼠月龄的变化关系进行综述。

1 不同月龄APP/PS1 小鼠在行为学实验中认知功能的变化

目前用于APP/PS1 小鼠认知能力的行为学实验方式主要为迷宫实验，迷宫实验中常用的检测装置有Morris 水迷宫、多臂水迷宫、T-型迷宫、十字迷宫实验等。实验中，APP/PS1 小鼠出现认知能力改变的月龄在不同迷宫实验装置中检测结果会有所不同。

1.1 APP/PS1 小鼠出现认知功能改变的月龄 在上述多种迷宫装置中，Morris 水迷宫是最常用的评价小鼠学习记忆水平的实验装置，主要的实验方法为:定位航行试验、空间探索试验分别对转基因小鼠的空间学习、空间记忆以及长时程记忆能力进行检测［3］，“逃避潜伏期”是应用最广泛的评价指标。Jankowsky 的实验团队在2005 年的研究表明，8 月龄APP/PS1 小鼠在Morris 水迷宫实验装置中已经能够检测到认知功能的改变［4］，而后的实验中，发现双转基因小鼠可能于6～8 月龄在Morries 水迷宫中开始出现认知功能改变［5］。而其他的迷宫实验装置，尚未能发现小鼠出现行为学改变月龄的规律。如Xiong［6］等则发现6 月龄的双转基因鼠在多臂水迷宫中进入错误臂的平均次数才开始明显的多于野生鼠，但OLeary［7］在巴恩斯迷宫中检测到16 月龄双转鼠才与野生鼠明显的认知功能区别。综上所述，不同的实验装置检测到双转鼠出现认知功能改变的月龄是不同的。即使是同一实验装置，可能由于小鼠个体间的差异或实验方法操作的影响，检测结果也会有所不同。

1.2 随着月龄的增加双转基因小鼠认知功能的变化FAD 患者的认知功能会随着病程的延长而不断下降。故用以模拟AD 病理规律的APP/PS1 双转小鼠在行为学实验中的表现与月龄间也可能存在某种相关性，经过对实验文献的总结，在不同的迷宫实验装置中月龄与认知功能间的关系主要体现于两个方面。一是随着月龄的增加，双转基因鼠在迷宫实验中认知功能损害逐渐加重;二是与野生鼠相比，月龄越大的双转基因鼠在行为学实验中学习记忆能力越差。在Morries 水迷宫实验装置中，大部分6～18 月龄区间的双转小鼠均可检测到认知能力呈逐渐下降的趋势［8，9］。且低月龄(小于等于5月龄)双转基因鼠与野生鼠相比经多次训练后，二者间逃避潜伏期下降趋势差别很小。而(5 月龄以上)双转基因鼠与野生鼠同样次数的训练后，其逃避潜伏期反映出明显的学习记忆能力下降。在其他迷宫实验装置，双转基因鼠与野生鼠相比逃避潜伏期也反应出相同的趋势［10，11］。综上所述，在应用迷宫装置的行为学实验中，APP/PS1 双转基因小鼠的认知功能与月龄间存在一定的规律，从实验结果中可看出，随着月龄的增加，与野生鼠相比APP/PS1 鼠的认知功能受损程度在不断加重，其学习记忆能力的损害可能最为明显。

2 不同月龄小鼠脑内Aβ 水平的情况

2.1 Aβ 沉积于APP/PS1 小鼠脑内形成淀粉样斑块的实验检测 APP/PS1 双转基因鼠脑内模拟了Aβ 过量沉积，形成淀粉样神经炎性斑块等人类AD 的病理变化。目前常用的APP/PS1 双转鼠模型Aβ 检测指标有，脑内Aβ1-42和Aβ1-40、老年斑等。检测Aβ 的实验方法有ELISA 检测法、硫磺素S(Thioflavin-S)荧光染色检测法等，前者用于脑组织中的Aβ1-40及Aβ1-42的观察，后者用于脑内纤维性β-淀粉样蛋白斑块的检测。Jankowsky 认为APP/PS1 小鼠［12］约在6 月龄即可见脑内淀粉样斑块沉积，18 月龄时沉积程度最为严重。如Garcia［13］使用体内双光子显微镜直接观察到小鼠在6～7 月龄脑内出现淀粉样斑块，并用硫磺素-S 荧光染色法示4 月龄小鼠脑内仅有极少量可检测的斑块，斑块负荷甚至接近0%，6 月龄时斑块数量约80/ mm2，斑块负荷约1.7%。且发现同一实验中6 月龄鼠脑内斑块数量约为45 块，8 月龄约为170 块，12 月龄约为220 块。平均斑块面积和负荷也呈逐步上升趋势。本实验方法同样可定位老年斑在小鼠脑内的分布，在APP/PS1 小鼠皮质和海马中Aβ 淀粉样沉积所形成的斑块被染色后显影最多。低月龄APP/PS1 小鼠脑内Aβ水平与同月龄野生鼠基本相同，约在4 月龄少量沉积，但直到6～7 月龄才能用ELISA 法检测到。所检测的Aβ 沉积总量在双转基因鼠4～12 月龄内应呈逐渐增加的趋势［14］由于Aβ 在APP/PS1 小鼠脑内以多种形式存在，可以肯定不可溶性Aβ1-40和Aβ1-42的总量在脑内的沉积呈增长趋势，但可溶性Aβ 量的变化则尚无定论。

2.2 Aβ1-40与Aβ1-42随月龄比值的变化 APP/PS1 小鼠脑内淀粉样蛋白形成的速率与Aβ1-40∶ Aβ1-42的比率变化直接相关［15］。两者中增加速度最快的可能与老年斑形成的相关性最大。由于不同实验中ELISA 检测采用的匀浆方法、试剂盒等实验过程千差万别，因此计算Aβ1-40与Aβ1-42的比值是验证Aβ 致病性的最好方式。通常认为6 月龄时Aβ1-40∶Aβ1-42通常约为0.75∶ 1。且随着月龄的增加，Aβ1-40总量∶Aβ1-42总量的比值逐渐应先增大后减小。综上，APP/PS1 小鼠脑内Aβ 沉积会随着月龄的增加而加重，选择6～7 月龄开始检测APP/PS1 双转基因小鼠小鼠脑内Aβ 沉积水平也许为最佳，但也有实验者对此持相反意见，认为3 月龄开始即可检测到脑内Aβ 沉积。一般认为Aβ 沉积主要沉积与小鼠脑内的皮质颞侧部与海马［16］。Aβ1-42/1-40比值变化与月龄间可能没有相关性，该比值可能为Aβ1-42的沉积独立于Aβ1-40沉积的证据。同时也是判断Aβ1-40和1-42致病性的最佳指标。

3 小鼠脑内Aβ 情况与认知功能改变相关性评价

3.1 实验的系统误差影响认知行为学及Aβ 水平数据系统误差主要为性别、基因突变造成的表达差异、生长环境等因素。由于AD 发病除了年龄因素外，还有性别、基因突变、教育程度等因素的影响。对于APP/PS1 双转基因小鼠模型，因此我们根据AD 的发病过程，期望小鼠能够在“高龄”时先出现Aβ 过量沉积形成老年斑，再产生行为学改变(学习记忆能力下降，认知功能损害)。但事实上，许多因素影响了APP/PS1 双转基因鼠在AD 病理学实验中的表现。(1)性别，目前普遍认为雄性APP/PS1 鼠在行为学检测中出现认知功能下降的月龄要晚于相同条件下饲养的雌性，雌性小鼠的Aβ1-40和1-42 水平以及出现的斑块数量都要高于同月龄的雄性小鼠［17］。这可能是受到性激素的影响出现的结果。(2)小鼠传代时的基因突变导致后代表达的差异。如脑源性神经营养因子基因(Bndf)，它的表达缺失会是造成APP/PS1 小鼠的过度肥胖，从而造成行为学检测结果的误差。并且可以肯定其对ELISA 检测法的结果有着影响。(3)小鼠饲养环境的因素，2003 年Jankowsky 实验室探索性的检测了饲养环境因素对小鼠脑内Aβ 沉积的影响，发现APP/PS1 小鼠在外界刺激丰富的环境下长大比在标准动物房饲养长大脑内Aβ 的沉积量有很大区别。综上，对于APP/PS1小鼠模型，存在多种外界及自身对实验造成的系统误差，这些误差不可避免的要对小鼠的行为学检测和脑内Aβ 沉积过程造成影响。

3.2 从不同Aβ 致病理论的角度探究 Aβ 级联假说作为AD 发病的主要假说，其并未完全阐明Aβ 如何造成认知功能减退，因此学者们提出几种假说以更深入阐明Aβ 导致认知功能减退的机制。(1)实验者们认为这是由脑内Aβ 的某种早期聚集形式导致，即“Aβ 寡聚体”。早期月龄Aβ 可溶性寡聚体早于Aβ 沉积形成板块，产生神经毒性影响突触功能导致认知功能下降。之后老年斑块沉积大量出现，此时寡聚体和淀粉样斑块共同存在于脑内，产生神经毒性使主宰神经认知功能的神经元、突触的结构及功能进一步损害。这也可以让我们从病理学角度解释为什么一些实验中小鼠学习记忆能力下降发生早于Aβ 过量沉积形成老年斑。(2)APP/PS1 小鼠个体间行为学检测结果的差异可能因学习记忆系统的不同方面对Aβ 沉积所产生毒性的敏感度不同。如情景记忆能力比空间参考记忆能力对Aβ1-42的变化更敏感，长期记忆能力则可能受到寡聚体的直接影响。(3)寡聚体诱发的小鼠早期认知功能下降是可逆的，即当饲养过程中小鼠受到外界环境的影响或实验者的主观行为对小鼠的行为学实验进行干预(如故意将模型组在离平台远的位置入水)，可能导致认知功能损害出现组间和组内统计学差异。最后，大鼠的Morris 水迷宫任务是由海马、纹状体、丘脑、前脑以及小脑等多个脑区共同协调，任何脑区的损害或脑区间联系的破坏都会影响这一功能的实现。多数以APP/PS1 小鼠模型实验中，海马内Aβ 水平和老年斑密度远超过其他脑区，行为学实验中长期记忆能力普遍有损害症状，这可能是与老年斑产生神经毒性导致海马内神经突触损伤有关。综上，Aβ 与小鼠认知功能下降间的相关性仍然难以准确得出结论。

4 小 结

APP/PS1 转基因鼠动物模型成功模拟了AD 发病的某些方面，如行为学检测中认知功能随月龄的增加而下降，脑内Aβ 沉积随着月龄的增长而加重。Aβ 可能是AD 神经认知功能损害的始发因子，启动了神经退行性变，所以APP/PS1 双转基因小鼠早期月龄的认知功能改变与Aβ 水平存在相关但非线性关系。但小鼠脑内存在多种形式的Aβ(脑间质液和细胞内的可溶性Aβ、纤维性Aβ、Aβ 寡聚体)。它们对认知功能损害的大小及同步性尚不清楚。且神经炎性斑块中的Aβ 沉积可能是代谢的副产品，也许神经炎性斑块的程度和Aβ 水平不能用于神经病理变化程度的评估。转基因小鼠可用于AD 发病机制研究及疗效评估研究。AD 发病与哪个脑区的哪种Aβ 相关尚需要进一步深入研究;选取哪种Aβ 相关指标也是疗效评估的关键点。

［1］Rosenkranz SC，Geissen M，Hrter K，et al.Amyloid-precursor-proteinlowering small molecules for disease modifying therapy of Alzheimer’s disease［J］.PLoS One，2013，8(12):e82255.

［2］Meraz-Rios MA，Franco-Bocanegra D，Toral Rios D，et al.Early onset Alzheimer’s disease and oxidative stress［J］.Oxid Med Cell Longev，2014，14:375 -968.

［3］Vorhees CV，Williams MT.Morris water maze:procedures for assessing spatial and related forms of learning and memory［J］.Nat Protoc，2006，1(2):848 -858.

［4］Jankowsky JL，Melnikova T，Fadale DJ，et al.Environmental enrichment mitigates cognitive deficits in a mouse model of Alzheimer’s disease［J］.J Neurosci，2005，25(21):5217 -5224.

［5］Kim TK，Han HE，Kim H，et al.Expression of the plant viral protease NIA in the brain of a mouse model of Alzheimer’s disease mitigates Aβ pathology and improves cognitive function［J］.Exp Mol Med，2012，44(12):740 -748.

［6］Xiong H，Callaghan D，Wodzinska J，et al.Biochemical and behavioral characterization of the double transgenic mouse model (APPswe/PS1dE9)of Alzheimer’s disease［J］.Neurosci Bull，2011，27(4):221-232.

［7］O’Leary TP，Brown RE.Visuo-spatial learning and memory deficits on the Barnes maze in the 16-month-old APPswe/PS1dE9 mouse model of Alzheimer’s disease［J］.Behav Brain Res，2009，201(1):120-127.

［8］Minkeviciene R，Ihalainen J，Malm T，et al.Age-related decrease in stimulated glutamate release and vesicular glutamate transporters in APP/PS1 transgenic and wild-type mice［J］.J Neurochem，2008，105(3):584-594.

［9］Gimbel DA，Nygaard HB，Coffey EE，et al.Memory impairment in transgenic Alzheimer mice requires cellular prion protein［J］.J Neurosci，2010，30(18):6367 -6374.

［10］Filali M，Lalonde R，Rivest S.Cognitive and non-cognitive behaviors in an APPswe/PS1 bigenic model of Alzheimer’s disease［J］.Genes Brain Behav，2009，8(2):143 -148.

［11］Cao D，Lu H，Lewis TL，et al.Intake of sucrose-sweetened water induces insulin resistance and exacerbates memory deficits and amyloidosis in a transgenic mouse model of Alzheimer disease［J］.J Biol Chem，2007，282(50):36275 -36282.

［12］Reiserer RS，Harrison FE，Syverud DC，et al.Impaired spatial learning in the APPSwe+PSEN1DE9 bigenic mouse model of Alzheimer’s disease［J］.Genes Brain Behav，2007，6(1):54 -65.

［13］Garcia-Alloza M，Gregory J，Kuchibhotla KV，et al.Cerebrovascular lesions induce transient β-amyloid deposition［J］.Brain，2011，134(12):3697 -3670.

［14］Lee JE，Han PL.An update of animal models of Alzheimer disease with a reevaluation of plaque depositions［J］.Exp Neurobiol，2013，22(2):84 -95.

［15］Holcomb L，Gordon MN，McGowan E，et al.Accelerated Alzheimertype phenotype in transgenic mice carrying both mutant amyloid precursor protein and presenilin-1 transgenes［J］.Nat Med，1998，4(1):97 -100.

［16］Liu Y，Yoo MJ，Savonenko A，et al.Amyloid pathology is associated with progressive monoaminergic neurodegeneration in a transgenic mouse model of Alzheimer’s disease［J］.J Neurosci，2008，28:13805 -13814.

［17］Wang J，Tanila H，Puolivli J，et al.Gender differences in the amount and deposition of amyloid beta in APPswe and PS1 double transgenic mice［J］.Neurobiol Dis，2003，14(3):318 -327.