补肾壮骨丸抗骨质疏松的药效学作用及机制探讨

邢爽++++++康学

[摘要] 目的 探讨北京积水潭医院院内制剂补肾壮骨丸抗骨质疏松的药效学作用及其机制。 方法 6个月龄雌性SD大鼠60只，随机分为正常对照组、模型对照组、补肾壮骨丸低（1.2 g/kg）、中（2.4 g/kg）、高（4.8 g/kg）剂量组以及阳性药雷洛昔芬组，每组10只。双侧卵巢摘除术建立大鼠骨质疏松模型，去势手术1周后，补肾壮骨丸低、中、高剂量组及阳性药组分别灌胃给予不同剂量补肾壮骨丸混悬液及雷洛昔芬混悬液治疗12周，正常及模型对照组灌服等体积的生理盐水。分别检测血清碱性磷酸酶（ALP）、抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）、甲状旁腺激素（PTH）、促甲状腺激素（CT）以及垂体-性腺轴相关激素雌二醇（E2）、睾酮（T）、黄体生成素（LH）、卵泡刺激素（FSH）含量；测定骨密度、骨生物力学性能。 结果 去势后，模型对照组血清ALP、TRAP、PTH活性显著升高（P < 0.05或P < 0.01），含量分别为（16.347±2.957）U/100 mL、（27.691±7.042）U/L、（45.829±17.007）pg/mL，CT水平显著下降，含量为（20.469±7.343）pg/mL，全股骨和股骨头骨密度为（0.1859±0.0137）、（0.1871±0.0193）g/cm2，股骨最大载荷为（63.448±17.540）N，最大挠度为（0.5848±0.1595）mm，均较正常对照组显著降低（P < 0.05或P < 0.01）；性激素E2和T含量显著降低（P < 0.01），分别为（5.935±1.621）pg/mL、（3.382±1.405）ng/mL，促性腺激素LH和FSH水平明显上调（P < 0.05），含量分别为（12.549±2.376）、（15.841±1.896）mU/mL；与模型对照组比较，补肾壮骨丸中、高剂量组ALP含量为（13.619±2.881）、（12.720±3.044）U/100 mL，TRAP含量为（20.904±6.454）、（19.933±5.988）U/L，PTH含量为（26.753±13.013）、（25.630±15.618）pg/mL，三者活性均显著下调（P < 0.05或P < 0.01）；高剂量组CT含量显著升高，为（28.350±7.827）pg/mL，中、高剂量组全股骨密度及高剂量组股骨头密度显著升高，分别为（0.2081±0.0113）、（0.2135±0.0139）、（0.2304±0.0290）g/cm2，高剂量组股骨最大载荷及挠度分别为（81.314±16.413）N、（0.7358±0.1488）mm，较模型组显著升高（P < 0.05）；高剂量组E2、T显著升高（P < 0.05或P < 0.01），含量为（8.799±2.204）pg/mL、（5.086±1.668）ng/mL；中、高LH含量分别为（10.740±1.652）、（10.575±0.886）mU/mL，FSH含量分别为（13.244±2.089）、（13.348±2.170）mU/mL，二者水平均显著下调（均P < 0.05）。 结论 补肾壮骨丸可有效纠正骨代谢异常，增加骨密度，增强生物力学性能，其发挥抗骨质疏松作用的部分机制与其调节垂体-性腺轴相关激素水平有关。

[关键词] 骨质疏松；去势；补肾壮骨丸；药效及机制研究

[中图分类号] R285.5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2015）01（c）-0024-05

骨质疏松症（osteoporosis，OP）是以骨质量降低，骨组织纤维结构退化，继而引发骨骼脆性及骨折危险性增加为特征的系统性骨病，该病已跃居世界常见病发病率的第7位[1]，由OP引起的严重的医疗和社会负担，已成为全球公共卫生问题。由于骨属于雌激素依赖性组织，因而绝经后骨质疏松症（postmenopausal osteoporosis，PMOP）在原发性OP中占有很大比例。目前西药治疗现状并不理想，而中医药着重辨证论治，在防治该病方面显现出较大的优势。无论OP还是PMOP均属于中医“骨痿”范畴，中医认为其发生首先当责之于肾精亏虚[2]，故补肾填精壮骨是治疗该病的根本大法。补肾壮骨丸是北京积水潭医院（以下简称“我院”）院内制剂，具有补肾填精、强筋壮骨之功，正切合PMOP之肾虚精亏的中医发病病机。本实验通过去势建立经典的大鼠骨质疏松模型，探讨补肾壮骨丸抗OP的药效学作用及其机制，为该制剂的进一步临床应用提供可靠的实验依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Biofuge 15R低温生物离心机（德国Heraeus SEPATECH公司）；UV-1700型分光光度计（日本岛津公司）；CP224C型万分之一电子分析天平（奥豪斯仪器有限公司）；R-911型全自动放免仪（中国科技大学实业总公司）；尼康ECLIPSE 80i型生物显微镜附图像分析软件（锐驰恒业仪器科技有限公司）；Lexxos-2000型双能X射线骨密度仪（法国MEDILINK公司）；WD-1型电子万能试验机（长春非金属试验机厂）；莱卡RM2235型切片机（上海莱卡仪器有限公司）；Multiskan MK3型全自动酶标仪（美国THERMO公司）。

1.2 动物

清洁级6个月龄健康雌性SD大鼠60只，由北京维通利华实验动物技术股份有限公司提供，合格证号：SCXK（京）2013-0001。

1.3 药品与试剂

药品：补肾壮骨丸（北京积水潭医院院内制剂，京药制字Z20053696，批号：140412，规格：每100粒重20 g）；雷洛昔芬片（商品名：易维特，礼来制药有限公司，批号：L02576，每片重0.2585 g，相当于以C28H27NO4S·HCl计60 mg）；戊巴比妥钠（天津市光复精细化工研究所，批号：20120527）。

试剂：碱性磷酸酶（ALP）、抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号分别为：20130925、20131021）；甲状旁腺激素（PTH）、促甲状腺激素（CT）酶联免疫试剂盒（美国BG公司，批号E02P0572、E02C0404）；睾酮（T）、雌二醇（E2）、促黄体生成素（LH）、卵泡刺激素（FSH）放免测试盒（北京华英生物技术研究所，批号分别为：20131125T、20131205E、20131130L、20131129L）。

2 方法

2.1 分组

60只大鼠按随机数字表法分为6组，每组10只。包括正常对照组、模型对照组、补肾壮骨丸低（1.2 g/kg）、中（2.4 g/kg）、高（4.8 g/kg）剂量组、雷洛昔芬组。自由饮水、摄食。

2.2 造模

施行手术造模法，术前8 h禁食，在无菌条件下，各组大鼠均用1%戊巴比妥钠（40～50 mg/kg）腹腔内注射麻醉，腹腔正中切口。除正常对照组外，各组大鼠均行双侧卵巢摘除术；正常对照组用同样手术入路暴露卵巢，切除少量脂肪，不摘除卵巢。术后每只大鼠给予青霉素钠盐5 U/d，连续用3 d。

2.3 给药

去势手术1周后，各组动物灌胃给予相应的药物或生理盐水，每日1次，连续给药12周。① 补肾壮骨丸低、中、高剂量组：分别给予补肾壮骨丸混悬液1.2、2.4、4.8 g/kg体重灌胃（中剂量组用量相当于临床等效剂量）；②雷洛昔芬组：雷洛昔芬片6.25 mg/kg体重灌胃；③正常对照组、模型对照组：灌服与用药组等体积的生理盐水。

2.4 取材及检测

禁食16 h后，腹腔麻醉，腹主动脉取血，离心取血清，按照试剂盒说明书，比色法检测血清ALP、TRAP含量，酶免法检测血清PTH、CT含量，放免法检测血清E2、T、LH、FSH水平。分离大鼠的左右两侧股骨，剥除其附着的肌肉及结缔组织，左侧用生理盐水浸泡的湿纱布包裹置于-20℃保存，用于骨密度以及生物力学检测；右侧以10%甲醛溶液固定，行病理组织形态计量学检测。

2.5 统计学方法

采用SPSS 17.0 for Windows软件包完成。符合正态分布的数据采用均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用方差齐性检验及单因素方差分析，根据方差齐性检验结果选择LSD（方差齐）或Tamhane′s T2（方差不齐）进行数据分析；非正态分布的数据采用非参数检验方法。以P < 0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 各组大鼠血清ALP、TRAP含量的比较

与正常对照组比较，模型对照组血清ALP、TRAP含量均显著升高（均P < 0.01）。与模型对照组比较，补肾壮骨丸中、高剂量组以及阳性药雷洛昔芬组二者水平均显著降低（P < 0.05或P < 0.01）。见表1。

3.2 各组大鼠血清PTH、CT含量的比较

与正常对照组比较，模型对照组血清PTH含量显著升高（P < 0.01），CT含量显著下降（P < 0.05）。补肾壮骨丸各剂量组及雷洛昔芬组PTH水平显著降低（均P < 0.01）；仅补肾壮骨丸高剂量组及雷洛昔芬组可显著升高血清CT含量（均P < 0.05）。见表2。

3.3 各组大鼠骨密度的比较

各组大鼠骨密度扫描结果显示：模型对照组全股骨及股骨头处骨密度均较正常对照组显著降低（均P < 0.01）。经治疗后，补肾壮骨丸高剂量组及雷洛昔芬组两处骨密度均明显升高（P < 0.05或P < 0.01），中剂量组仅能显著增加全股骨骨密度（P < 0.01）。见表3。

3.4 各组大鼠骨生物力学性能的比较

生物力学测试结果显示：与正常对照组比较，模型对照组股骨最大载荷量及最大挠度均明显下降（P < 0.05或P < 0.01）。补肾壮骨丸高剂量组及雷洛昔芬组能显著提高股骨最大载荷及最大挠度（均P < 0.05）。见表4。

3.5 各组大鼠垂体-性腺轴相关激素水平的比较

性腺轴相关激素水平检测结果显示：造模后，大鼠血清E2、T含量均显著下降（均P < 0.01），而促性腺激素LH和FSH水平显著上调（均P < 0.05）。与模型对照组比较，补肾壮骨丸中、高剂量组及雷洛昔芬组血清E2含量显著升高（P < 0.05或P < 0.01），仅高剂量能显著提高血清T含量；补肾壮骨丸中、高剂量组及雷洛昔芬组血清LH、FSH水平较模型对照组显著下调（均P < 0.05）。见表5。

4 讨论

OP是老龄化社会卫生保健的一个突出问题，得到了世界各国医学界的普遍重视。其中，最为常见且比例较大的PMOP是由于绝经后雌激素水平骤减，导致骨吸收大于骨形成，出现以低骨量和骨组织结构退行性病变的全身代谢性骨病[3]。据调查，OP患病率女性是男性的2.73倍，尤其绝经后激素水平急剧下降，OP发病率显著升高，且年龄每增加10岁，OP患病风险增加1.4～1.8倍[4]。因此，有效防治这一高发性骨病，筛选开发出安全高效的抗OP新药物是现代医学亟待解决的重要问题。

西医用药主要是针对发病的病理环节，采用补充雌激素、骨吸收抑制剂、骨形成促进剂等，这种单点局限治疗对于OP这一复杂病变难奏长效，加之治疗费用高、副作用较大及其潜在的致癌性[5-6]，使其应用受到限制，故治疗现状尚不理想。中医药治疗着重调动内因、辨证论治，最终达到纠正机体激素失衡和负钙平衡的功效。中医学将该病归属于“骨痿”、“骨痹”范畴，认为五脏虚损和气血功能紊乱与PMOP发病密切相关，肾虚、脾虚、血瘀等为基本病机，其中肾虚精亏是核心病机[7]，正如《素问·痿论》云：“肾气热，则腰脊不举，骨枯而髓减，发为骨痿”，尤其绝经伴随年龄的增长到“女子七七天癸竭”，肾中精亏髓虚，骨髓生源不足，不能濡养骨骼，则发为腰膝酸软、行走不便的“骨痿”。现代医学认为，肾精相当于性激素及促性腺激素，与垂体-性腺轴系统作用有惊人的相似之处[8]。由此可见，“肾虚精亏、天癸竭”中医病机与现代医学认为雌激素缺乏是PMOP的首要病因这一理论是相吻合的。因此，补肾填精壮骨之法是治疗PMOP的根本大法。

北京积水潭医院院内制剂补肾壮骨丸主要由补骨脂、鹿角霜、龟甲、牛膝、三七、土鳖虫等组成，具有补肾填精，强筋壮骨，益气活血的功效，用于肾虚腰背酸痛，足膝软弱，疲倦乏力，畏寒肢冷，自汗，盗汗，五心烦热等症及骨质疏松等。本研究通过骨代谢生化以及直观评价OP的指标来评价补肾壮骨丸抗OP的药效学作用，并以性激素缺乏是PMOP的首要病因这一理论以切入点，通过研究垂体-性腺轴相关激素水平的变化，探讨药物防治OP的作用机制，以期更好地为该制剂的临床应用提供依据。

骨代谢生化指标可动态观察骨转换代谢过程，对评价骨质量、监测药物疗效有着重要意义。ALP是成骨细胞分化的早期标志物，血ALP可作为评价骨形成能力和骨转换率的特异性生化指标，其活性在破骨或成骨占优势时均升高[9]。TRAP由破骨细胞分泌释放，血清中TRAP的水平可以反映体内OC活性和骨吸收状态[10]。本研究结果显示：大鼠去势后，血清ALP和TRAP水平均显著升高，提示骨代谢处于骨吸收大于骨形成的负平衡状态，补肾壮骨丸可明显下调二者水平，提示该制剂能够有效逆转高转换型骨代谢状态，从而使骨吸收和骨形成之间的偶联趋于平衡。PTH和CT是调节机体钙磷代谢和骨组织新陈代谢的重要激素。血PTH对骨的作用是通过刺激破骨细胞活性来促进骨吸收[11]。本研究中经药物干预后大鼠血PTH含量明显降低，CT水平显著升高，说明补肾壮骨丸能通过抑制机体PTH水平来抑制骨吸收，通过影响钙调节激素PTH和CT的水平来改善骨代谢进而防止OP。

联合直观反映OP的药效学指标能够更全面、合理地评价骨转换状态以及药物干预治疗效果。骨密度已被看作是临床诊断OP的“金标准”；骨生物力学性能是决定骨强度和对脆性骨折风险进行评定的可靠方法[12]；此外，OP的主要病理表现是骨组织显微结构的异常，因此，骨组织病理形态可作为直观反映骨量评价骨转换与骨结构不可或缺的关键性指标[13]。本研究结果显示：造模后，OP大鼠骨密度显著下降，股骨最大载荷和挠度均明显降低，且显微结构出现典型的骨质疏松样改变；补肾壮骨丸干预治疗后，上述指标均明显改善，提示该制剂可通过增加骨密度，增强结构力学性能，逆转骨组织病理样改变而发挥抗OP作用。

由于雌激素水平骤减，造成破骨细胞活性明显增强，骨转换加快已是公认的PMOP发生的首要原因。中医所言的“肾虚精亏”与该理论相吻合，故因此为切入点来探讨药物作用的可能机制。雄激素可刺激成骨细胞和骨细胞的增殖、分化，其减少与骨丢失相关；雌激素在骨吸收方面起主导作用，其含量下降可导致骨转换活跃和骨密度降低[14]。此外，垂体-性腺轴各个水平的激素之间都存在着纽带联系，上游激素FSH和LH可作用于性腺，调节性激素的生成、释放，同样会被性激素反馈性抑制[15]。本研究显示：行去势术后，OP大鼠雌雄激素水平骤减，促性腺激素分泌反馈性异常升高，提示性激素水平低下及相关激素分泌紊乱是导致骨代谢异常的重要原因之一。经补肾壮骨丸治疗后能显著提高性激素水平，纠正促性腺激素的异常分泌，提示垂体-性腺轴相关激素水平的整体调节作用可能是该制剂防治OP的作用机制之一。

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（收稿日期：2014-11-02 本文编辑：卫 轲）