蓬子菜中活性成分DXG大鼠血浆蛋白结合率测定

崔明宇，孙志伟，李艳凤，马英丽

(1. 黑龙江中医药大学 药学院，哈尔滨 150040；2. 哈尔滨商业大学 药学院，哈尔滨 150076)

蓬子菜中活性成分DXG大鼠血浆蛋白结合率测定

崔明宇1，孙志伟2，李艳凤1，马英丽1

(1. 黑龙江中医药大学 药学院，哈尔滨 150040；2. 哈尔滨商业大学 药学院，哈尔滨 150076)

考察蓬子菜中活性成分DXG在大鼠血浆中的蛋白结合情况.采用平衡透析法测定DXG的大鼠血浆蛋白结合率.建立DXG透析外液和透析内液的HPLC测定方法，求得高、中、低不同质量浓度下，DXG的血浆蛋白结合率分别为29.39%，29.85%，32.94.该方法专属性强，灵敏度高，符合生物样品测定要求要求.DXG的大鼠血浆蛋白结合率较低，且不具有质量浓度依赖性.

蓬子菜；DXG；血浆蛋白结合率；平衡透析法

蓬子菜(Galium verum L.)为茜草科(Rubiaceae)拉拉藤(Galium)属植物蓬子菜的干燥全草，性温，味苦、甘，具有清热解毒、利胆、利湿止痒、行血的功效.蓬子菜制剂在临床上用于治疗血管系统疾病取得了良好的效果[1]，DXG(diosmetin-7-O-b-D-xylopyranosyl-(1(6)-b-D-glucopyranoside)为蓬子菜(Galium verum L.)有效部位中分离得到的高含量活性指标成分，药理研究表明DXG对过氧化氢损伤的人脐静脉内皮细胞具有显著的保护和修复作用，使内皮素(ET-1)水平降低，降钙素基因相关肽(CGRP)水平升高[2].血浆蛋白结合率是重要的药动学参数，影响药物在体内的动态变化过程，进一步影响药物的消除半衰期及药理作用强度.本文采用平衡透析法考察了DXG与大鼠血浆蛋白的结合情况，为新药开发及保证合理的临床用药提供参考依据.

1 实验材料

1.1 药品与试剂

DXG对照品(实验室自提，质量分数≥98%)；DXG (实验室自提，质量分数≥90%)；甲醇(色谱纯，DIMA公司)；磷酸 (分析纯) ；醋酸(分析纯，天津市耀华化学试剂厂)；肝素钠(北京奥博星生物技术公司)；EDTA(天津市恒兴化学试剂制造公司)；磷酸二氢钾(分析纯，天津市津东天正化学公司) ；氯化钠(分析纯，天津市广成化学试剂公司)； 氢氧化钠(天津市津东天正化学公司)；超纯水.

1.2 实验仪器

高效液相色谱仪(LC-2010A，岛津公司)、紫外检测器(SPD-M10 AVP)；色谱工作站(Class-VP)；空气浴振荡器(HZQ-C，常州诺基仪器有限公司)；BF-2000 氮吹仪(北京八方世纪科技有限公司)；高速台式离心机(TGL-16C，上海安亭科学仪器厂)；涡旋混合器(XW-SOC，上海医用仪器厂)；透析袋(MW 8000-14000，美国Sigma公司)；电子天平(BT25S，德国Sartorius公司).

1.3 实验动物

Wistar大鼠(雄性，(220±20) g；黑龙江中医药大学安全评价中心；许可证号：SYXK黑2008001).大鼠眼眶取血，肝素抗凝，5 000 r/min离心10 min，分离上层血浆备用.

2 方法

2.1 溶液的配制

2.1.1透析液的配制

精密称取磷酸二氢钾2.74 g和氯化钠8.8 g加入0.1mol/L的氢氧化钠调节至pH=7.4，并定容至1 000 mL，即得pH=7.4的0.02 mol/L的磷酸盐缓冲液.

2.1.2DXG标准对照液的配制

精密称取DXG对照品适量，加70%乙醇溶解并定容至刻度，得0.3 mg/mL标准对照液.

2.1.3含药透析液的配制

分别精密称取DXG(质量分数≥90%)适量于25 mL容量瓶中，加空白透析液定容，得DXG质量浓度分别为125、250、500 μg/mL的含药透析液.

2.2 色谱条件

Hypersil ODS-2 色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)(大连伊利特公司)；流动相：甲醇-0.2%磷酸水 (39∶61)；检测波长：340 nm；流速：1 mL/min；柱温：35 ℃；灵敏度为0.2AUFS.

2.3 样品的处理

2.3.1透析内液(血浆)样品的处理

取透析内液100 μL，加甲醇400 μL，涡旋混合1 min后，离心 10 min(10 000 r/min)，精密吸取上清液400 μL氮气吹干，加流动相200 μL溶解，以0.45 μm微孔滤膜过滤，HPLC进样10 μL分析.

2.3.2透析外液(缓冲液)样品的处理

取透析外液100 μL，加甲醇400 μL，涡旋混合1 min后，离心 10 min(10 000 r/min)，精密吸取上清液400 μL氮气吹干，加流动相200 μL溶解，以0.45 μm微孔滤膜过滤，HPLC进样10 μL分析.

2.4 蛋白结合率的测定

2.4.1透析袋的处理

将透析袋剪成8 cm长的小段，置500 mL烧杯中，加入等体积的2%NaHCO3和1 mol/L的EDTA溶液，煮沸10 min，冷却后水洗，再用1 mol/L的EDTA溶液煮10 min，冷却水洗后，于EDTA溶液中冰箱保存备用(4 ℃)，用前以蒸馏水冲洗干净.

2.4.2平衡透析法测定蛋白结合率

将已预处理的透析袋一端扎紧，分别加入1mL空白血浆，扎紧，悬浮于装有10 mL不同质量浓度透析外液的离心管内，透析外液中DXG质量浓度分别为125、250、500 μg/mL，每组平行3份.调节透析袋内外液面，使其保持同一高度，将盖子旋紧，于37 ℃恒温振荡器中，透析达平衡后，取少量透析外液加等量的10%的高氯酸溶液，观察是否有蛋白外漏，漏出者作废.分别测定透析袋内、外药物的峰面积[3-5].

2.4.3平衡时间的考察

以磷酸缓冲液代替血浆置透析袋内，透析外液DXG质量浓度分别为125、250、500 μg/mL，置于37 ℃恒温振荡器中，分别于3、6、9、12、24、30、36 h测定透析袋内外DXG的质量浓度，以二者质量浓度比值确定平衡时间，结果发现在30 h之后透析袋内外质量浓度不再发生变化，故透析平衡时间采用30 h.

3 结 果

3.1 方法学考察

3.1.1专属性

制备DXG对照品、空白血浆、透析内液样品、透析外液样品，按2.3项下操作，HPLC每份进样10 μL，记录色谱图.DXG保留时间为8.9 min，并具有良好分离效果，样品在处理过程中未引入杂质；且血浆中内源性物质与透析液对DXG的分析测定无干扰.见图1(A)～(D).

图1 DXG不同样品中 HPLC色谱图

3.1.2线性关系

李林，任校长19年来，他把“引导学生走向幸福”作为学校的办学宗旨，积极探索教育规律，努力实施“以德立校，依法治校，科研兴校，文化强校”的办学策略，着力培养学生适应终身发展和社会发展需要的必备品格和关键能力。

1)透析内液标准曲线与线性范围

于100 μL空白血浆中加入100 μL不同质量浓度DXG标准对照液，使血浆中所含DXG质量浓度分别为3、9、15、21、27、33 μg/mL，按2.3项处理后，以DXG血药质量浓度为横坐标(C)，对照品峰面积为纵坐标(A)，进行线性回归，回归方程A=-2 536.5+17 206C(R2=0.999 7)，表明在3～33 μg/mL范围内具良好线性关系.

2)透析外液标准曲线与线性范围

100 μL透析外液中加入不同质量浓度DXG标准对照液各100 μL，使相应缓冲液中所含DXG质量浓度为10、11、12、13、14、15 μg/mL，按2.3项处理后，以DXG质量浓度为横坐标(C)，对照品峰面积为纵坐标(A)，进行线性回归，得回归方程A= 17 029C-494.29(R2= 0.999 9)，结果表明在10～15 μg/mL范围内线性关系良好.

3.1.3精密度与准确度

表1 血浆、透析液中DXG测定方法的精密度与回收率(n=5)

3. 1.4 提取回收率

分别取空白血浆与空白透析液100μL，按药物的质量浓度配制成低、中、高不同质量浓度的血浆样品溶液(3、15、30μg/mL)和透析外液样品溶液(11、13、15μg/mL)，按2.3项方法处理后进行HPLC分析.将样品处理后血浆和透析外液样品的峰面积，同未经样品处理的相同质量浓度的DXG标准溶液和透析外液直接进样所得峰面积相比.结果表明，不同质量浓度下，血浆和透析液的提取回收率达75%以上，且RSD<10%，方法符合生物样品测定要求.见表2.

表2 血浆、透析液中DXG的提取回收率(n=5)

3.1.5稳定性实验

取空白血浆和空白透析液，按2.3项方法预处理后配制成低、中、高不同质量浓度血浆样品溶液(3、15、30μg/mL)和透析外液样品溶液(11、13、15μg/mL)，考察血浆样品在-20 ℃冻融1周、室温放置24h及透析外液样品37 ℃放置36h后的稳定性.结果表明，血浆样品和透析外液样品在以上条件下具有良好的稳定性.

3.1.6透析膜对DXG的吸附性

将空白磷酸盐缓冲液1mL(设体积为V2)加入透析袋内，于透析袋外分别加入己知不同质量浓度CA(125 、250 、500μg/mL)的磷酸缓冲液10mL(设体积为Vl)，透析36h后，达平衡，测定透析袋外药物质量浓度(CE)，根据下式计算透析膜对药物的吸附率X，X= CA×V1-CE×(V1+V2)/CA×V1，实验结果表明透析袋对药物显微量吸附，可忽略不计.见表3.

表3 透析膜对DXG的吸附率

3.2 蛋白结合率

透析达平衡后，测定透析袋内、外的药物质量浓度A与B，根据公式F=(A-B)/A计算DXG血浆蛋白结合率.结果见表4，DXG低、中、高三个剂量大鼠血浆蛋白结合率较低，且无明显质量浓度依赖性.见表4.

表4 不同剂量药物的血浆蛋白结合率

4 讨 论

蛋白结合率测定实验结果表明，DXG低、中、高3个质量浓度的大鼠血浆蛋白结合率分别为29.39%、29.85%和32.94%.且在给药剂量范围内无质量浓度依赖性，属于蛋白结合率较低的药物，游离型药物质量浓度较高，可以推断DXG受病理状态及联合用药的相互作用影响较小，联合用药后游离型药物质量浓度在体内亦不会发生较大的变化，因此安全性较高.而根据低蛋白结合率推测游离型药物在体内分布速度会较快，易经过肾小球滤过排除体外，这与药动学参数求得DXG较短的分布与消除半衰期相吻合.

[1] 高 杰, 吴华臣, 陈文阁, 等. 康脉2号胶囊治疗下肢深静脉血栓形成98例[J]. 现代中西医结合杂志, 2009, 18(3): 259-260.

[2] 赵 钢, 吴明远, 田旭升, 等. 蓬子菜冲剂对降钙素基因相关肽和肾上腺髓质素水平的影响[J]. 中国中西医结合外科杂志, 2007, 13(1): 66-68.

[3] 马英丽, 卢卫红, 晓 敏, 等. 蓬子菜的化学成分研究[J]. 中草药, 2005, 36(10): 1464-1465.

[4] 曹露晔, 陈 子. 高效液相色谱法研究蓝萼甲素与大鼠血浆蛋白的结合率[J]. 中草药, 2007, 38(5): 693-695.

[5] 刘东亮, 耿 婷. 荆芥内酯大鼠血浆蛋白结合率的测定[J]. 中国新药杂志, 2012, 21(1): 21-25.

Determination of plasma protein binding rate of DXG from Galium verum L. in rat

CUI Ming-yu1, SUN Zhi-wei2, LI Yan-feng1, MA Ying-li1

(1. College of Pharmacy, Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin 150040, China;2. College of Pharmacy, Harbin University of Commerce, Harbin 150076)

To determinate the protein-bound fraction of serum of DXG from Galium verum L. Equilibrium dialysis was used to determine the in vitro binding rate of DXG to rat plasma. A HPLC method for determination of DXG dialysated inside solution and outer solution was established. Plasma protein binding rate of DXG in different concentration was 29.39%, 29.85%, 32.94%, respectively. The methods were specific and sensitive, which can be used in determination of biological specimen. The plasma protein binding of DXG in rats reveals a low binding and has no concentration dependence.

Galium verum L.; DXG; plasma protein binding rate; equilibrium dialysis

2015-03-04.

国家自然科学基金项目(201281274034)； 黑龙江省教育厅科学技术研究项目(12531625)

崔明宇(1971-)，女，博士，研究方向：中药活性成分及其药物动力学.

马英丽(1954-)，女，博士，教授，博士生导师，研究方向：中药活性成分及作用机制研究.

R96

A

1672-0946(2015)06-0678-04