HPLC法同时测定肝甦颗粒中白藜芦醇和绿原酸的含量

黄德福

HPLC法同时测定肝甦颗粒中白藜芦醇和绿原酸的含量

黄德福

目的建立同时测定肝甦颗粒中白藜芦醇和绿原酸含量的方法。方法采用高效液相色谱法(HPLC)。色谱柱为WondaSil C18(4.6 mm×150 mm, 5 μm), 流动相为乙腈-0.4%磷酸水溶液(25：75, V/V), 流速为1.0 ml/min, 检测波长为305 nm, 柱温为25℃, 进样量为20 μl。结果白藜芦醇的质量浓度在1.0～81.0 μg/ml与其峰面积呈良好的线性关系(r=0.9997), 平均加样回收率为100.5%(RSD=2.42%, n=6)；绿原酸的质量浓度在9.6～307.2 μg/ml与其峰面积呈良好的线性关系(r=0.9996), 平均加样回收率为99.7%(RSD=2.06%, n=6)。结论本方法准确、重现性好, 可用于肝甦颗粒的制剂质量控制。

高效液相色谱法；肝甦颗粒；绿原酸；白藜芦醇；含量测定

肝甦颗粒由茵陈、虎杖、赤芍、车前草等15味中药组成,通过水煎煮法提取而制成的颗粒剂。该方为院内协定方, 临床上用于治疗肝胆湿热、瘀血阻络、脾虚气滞所致黄疸不退,急慢性肝炎、肝衰竭见上述症候者。方中茵陈、车前草和虎杖均为君药, 其中茵陈具有清利湿热、保肝利胆之功效[1]；车前草具有利尿、抗菌、治疗慢性活动性肝炎的作用[2]；虎杖具有利胆退黄、清热解毒、破瘀、通经的功能[3]。茵陈和车前草均含有水溶性的绿原酸, 而虎杖中有效成分为水溶性差的白藜芦醇, 因此, 通过水煎煮法能否同时提取两种溶解性不同的有效物质, 需进一步验证。而目前该制剂主要通过薄层色谱法进行质量控制, 难以达到准确定量和验证的目的。为了更好地评价和控制制剂质量, 本实验通过建立高效液相色谱法(HPLC)同时测定肝甦颗粒中绿原酸和白藜芦醇含量,为该制剂的质量控制提供定量检测的方法, 并为提取工艺的进一步优化提供参考依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 UV-2550紫外分光光度计(日本岛津公司)；LC-2010AHT高效液相色谱议(日本岛津公司)；80-2台式离心机(北京精诚华泰仪表有限公司)；SB-5200DT超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司)；BS224S型电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)。

1.2 试药 白藜芦醇对照品(纯度98%, Sigma公司提供)；绿原酸对照品(纯度98%, Sigma公司提供)；肝甦颗粒(福建医科大学孟超肝胆医院制剂室提供, 批号：121128、121212、121213, 规格：9 g/袋)；乙腈、甲醇均为色谱纯；水为超纯水,其它试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：Wondasil C18(4.6 mm×150 mm, 5 μm)；流动相：乙腈-0.4%磷酸水溶液(25∶75, V/V)；检测波长：305 nm；流速：1.0 ml/min；柱温：25℃；进样量：20 μl。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取适量的绿原酸和白藜芦醇对照品, 分别置于10 ml容量瓶中, 用50%甲醇水溶液进行溶解稀释, 配成浓度均为1.0 mg/ml的溶液, 经0.45 μm微孔滤膜过滤, 备用。

2.2.2 阴性对照溶液的制备 取肝甦颗粒处方中去除虎杖、茵陈与车前草之后的其他12味药材按提取工艺制备样品,得阴性对照溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备 精密称取肝甦颗粒1.0 g, 加50%甲醇水溶液适量, 超声波处理10 min后定容至10 ml, 经离心(转速2500 r/min)处理10 min, 取上清液经0.45 μm 微孔滤膜过滤, 备用。

2.3 专属性试验 分别取阴性对照溶液、对照品溶液、供试品溶液, 按“2.1”项下色谱条件进样, 结果见图1。由图可知,各峰分离度良好, 供试品具有与对照品色谱图相对应的色谱峰, 而阴性样品在相应位置无色谱峰, 对检测亦无干扰。

图1 HPLC图

2.4 线性关系考察 精密吸取白藜芦醇对照品溶液, 以50%甲醇水溶液为溶剂, 配置系列浓度溶液, 按“2.1”项下色谱条件分别进样, 记录峰面积。以白藜芦醇质量浓度(C)为横坐标, 峰面积(A)为纵坐标, 进行线性回归, 得回归方程A=161401 C-47615(r=0.9997, n=6)。结果表明, 白藜芦醇在1.0～81.0 μg/ml浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系。

精密吸取绿原酸对照品溶液, 以50%甲醇水溶液为溶剂,配置系列浓度溶液, 按“2.1”项下色谱条件分别进样, 记录峰面积。以绿原酸质量浓度(C)为横坐标, 峰面积(A)为纵坐标, 进行线性回归, 得回归方程A=47998C+87671(r=0.9996, n=6)。结果表明, 绿原酸在9.60～307.20 μg/ml浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.5 精密度试验 分别精密量取两种对照品溶液连续进样, 各6次, 记录峰面积。经计算得, 绿原酸峰面积值的RSD=0.58%(n=6)；白藜芦醇峰面积值的RSD=0.43%(n=6), 结果表明仪器精密度良好。

2.6 重复性试验 分别精密称取同一批号样品适量, 各6份, 按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液, 按“2.1”项下色谱条件检测。结果表明, 样品中绿原酸的RSD=0.80%(n=6),白藜芦醇的RSD=1.93%(n=6), 表明本方法重复性良好。

2.7 稳定性试验 分别精密量取供试品溶液适量, 于0、2、4、8、12、24 h, 按“2.1”项下色谱条件检测。结果表明, 绿原酸的RSD=0.76%(n=6), 白藜芦醇的RSD=1.83%(n=6), 表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.8 加样回收率 分别称取已知白藜芦醇和绿原酸含量的样品6份, 每份1.0 g, 置于容量瓶中, 分别精密加入适量白藜芦醇和绿原酸的对照品溶液, 混匀后按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液, 按“2.1”项下色谱条件检测, 计算回收率。见表1。

2.9 样品测定 分别称取批号为121128、121212、121213三批供试样品适量, 按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液,再按“2.1”项下色谱条件检测, 记录峰面积, 结果。见表2。

表1 加样回收率试验结果(n=6)

表2 样品含量测定结果(n=3)

3 讨论

3.1 检测波长选择 通过紫外扫描知, 绿原酸在327 nm 处有最大吸收, 白藜芦醇在305 nm 处有最大吸收, 但白藜芦醇在327 nm 处吸收比较小, 而绿原酸在305 nm 处有较好吸收,为保证两待测组分能同时较好地被检测, 故选择305 nm作为检测波长。

3.2 处理溶剂选择 由于白藜芦醇难溶于水, 故样品前处理中分别考察了采用乙腈、乙醇、甲醇与水的混合溶液作为稀释液对含量测定的影响。实验中发现, 采用乙腈水溶液处理, 造成绿原酸含量测得值偏低；用乙醇水溶液处理, 绿原酸对照液出现两个峰, 白藜芦醇的峰形不对称；采用甲醇水溶液处理, 仅发现绿原酸对照液出现小峰, 经调整甲醇与水的比例后(即甲醇：水=1∶1, V/V)小峰消失。故选择50%甲醇水溶液进行样品和对照品的处理。

3.3 超声波处理时间的考察 样品前处理中, 分别考察了经超声波处理10、20、30 min对检测结果的影响。结果表明,经不同时间的超声波处理后, 样品测定结果无显著差异, 故只需选择超声波提取处理10 min即可。

3.4 流动相的筛选 本研究分别考察了甲醇-磷酸水溶液、乙腈-磷酸水溶液, 以及不同磷酸的量对分离效果的影响。结果表明, 采用流动相甲醇-磷酸水溶液, 绿原酸的峰形不好, 平均对称因子为0.56, 而白藜芦醇峰形较好, 平均对称因子为1.01, 通过调整磷酸的量, 绿原酸的峰形依旧无法改进。而采用流动相乙腈-磷酸水溶液, 绿原酸的峰形较好但出现小峰, 通过调整磷酸浓度至0.4%时, 小峰消失, 各待测组分保留时间适宜, 重现性好, 无拖尾现象。分析原因为绿原酸是有机酸, 在酸性流动相中可减少其电离状态, 而保持峰形稳定, 分离度好[4,5], 故确定以乙腈-0.4%磷酸水体系为流动相。

综上所述, 本研究建立的HPLC可同时测定肝甦颗粒中绿原酸和白藜芦醇的含量, 操作简便、灵敏、重现性良好,因此可作为该制剂的质量控制方法。但同时也发现肝甦颗粒中白藜芦醇的含量明显偏低, 可能是由于提取过程中的水煎煮工艺尚不能较完全提取出虎杖中的有效成分, 提示原有的提取工艺有待进一步的改进与完善。

[1]童珊珊, 徐亚萍, 金花, 等.绵茵陈提取液中绿原酸的测定及其抗氧化活性研究.江苏中医药, 2009, 41(4):57-59.

[2]夏玲红, 金冠钦, 孙黎, 等.车前草的化学成分与药理作用研究进展.中国药师, 2013, 16(2):294-296.

[3]施翠英, 邓放, 任波.应用HPLC法探究虎杖泻心汤中蒽醌类成分的含量. 中国药房, 2012, 23(11):1010-1012.

[4]陶君彦, 张晓昱, 黄志军, 等. HPLC 法同时测定木瓜中绿原酸、咖啡酸的含量.中国药房, 2007, 18(12):912-914.

[5]张雯丽, 孙冬晓, 董立华. RP-HPLC法同时测定金钱草和广金钱草中绿原酸、槲皮素和山柰酚的含量.西北药学杂志, 2013, 28(5):486-488.

Simultaneous content determination of resveratrol and chlorogenic acid by HPLC in Gansu granules

HUANG De-fu. Mengchao Hepatobiliary Hospital of Fujian Medical University, Fuzhou 350025, China

ObjectiveTo establish simultaneous content determination method of resveratrol and chlorogenic acid in Gansu granules.MethodsHigh performance liquid chromatography(HPLC) was applied, with chromatographic column as WondaSil C18 (4.6 mm×150 mm, 5 μm), mobile phase as acetonitrile-0.4% phosphoric acid solution (25∶75, V/V), flow velocity as 1.0 ml/min, determine wavelength as 305 nm, column temperature as 25℃, and sample volume as 20 μl.ResultsResveratrol in content of 1.0～81.0 μg/ml had good linear relation with its peak area (r=0.9997), and its average standard recovery rate was 100.5% (RSD=2.42%, n=6). Chlorogenic acid in content of 9.6～307.2 μg/ml had good linear relation with its peak area (r=0.9996), and its average standard recovery rate was 99.7% (RSD=2.06%, n=6).ConclusionThis method is accurate and repeatable, and it can be applied in quality control of Gansu granules.

High performance liquid chromatography; Gansu granules; Chlorogenic acid; Resveratrol; Content determination

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2015.18.212

2015-06-04]

350025 福建医科大学孟超肝胆医院