microRNA-148b在肝细胞癌组织中的表达及其临床意义

郝余庆　蒋徐维　徐玉振

(1.上海市宝山区中西医结合医院普外科，上海　201900；

2.江苏省徐州市中心医院胃肠外科，江苏徐州　221009)



·论著·

microRNA-148b在肝细胞癌组织中的表达及其临床意义

郝余庆1蒋徐维1徐玉振2

(1.上海市宝山区中西医结合医院普外科，上海201900；

2.江苏省徐州市中心医院胃肠外科，江苏徐州221009)

摘要目的：探讨肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)组织中microRNA-148b(miR-148b)的表达与HCC预后的关系。方法： 从上海中医药大学附属曙光医院冰冻组织样本库中调取2007—2010年手术切除的HCC组织及相应癌旁组织标本，采用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)法检测组织标本中miR-148b的表达情况，结合临床病理指标及生存资料，分析miR-148b表达改变的临床意义。结果：与癌旁组织比较，HCC组织中miR-148b表达水平显著降低(P<0.01)。miR-148b低表达与HCC血管侵犯及TNM分期等恶性临床病理指标相关。Kaplan-Meier生存曲线分析显示，miR-148b低表达组患者总生存率较低。结论：人HCC组织中miR-148b表达下降，且与HCC不良的临床预后有关。

关键词肝细胞癌；microRNA-148b；总生存期；预后

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是我国最常见的消化道恶性肿瘤，恶性程度高，病死率高[1]。在过去20年中，HCC发病率在全世界范围内迅速上升[2]。目前，手术切除HCC仍是使患者获得长期生存的最有效措施，但大部分HCC患者就诊时已属晚期，并多伴有严重的肝硬化，接受手术治疗者不到10%[3]。探索HCC侵袭转移机制、寻找新的临床治疗靶点在HCC的治疗中具有重要意义。

近年来研究[4-5]发现，包括HCC在内的多种恶性肿瘤的发生与细胞内DNA甲基化有关。启动子区高甲基化可导致一系列抑癌基因的转录失活，因而在恶性肿瘤的进展过程中具有重要作用。研究[6-7]发现，在HCC组织和细胞中DNA甲基转移酶DNMT3B表达显著上调，但其调控机制尚不清楚。有研究[8]认为microRNA-148b(miR-148b)对DNMT3B具有负调控作用。miR-148b可通过下调DNMT3B表达从而抑制细胞内DNA甲基化，因此，推测miR-148b可在一定程度上逆转肿瘤进展。研究表明，miR-148b在乳腺癌[9]、胃癌[10]、结肠癌[10]、胰腺癌[11]、肺癌[12]等多种肿瘤组织中低表达，且与肿瘤恶性表型和进展相关。然而，关于miR-148b在HCC组织中的表达情况及其与HCC患者的预后关系的研究报道，目前尚少见。本研究通过检测miR-148b在HCC组织中的表达情况，并分析miR-148b的表达水平与HCC患者的临床病理指标及随访资料的关系，探讨miR-148b的表达与HCC患者临床预后的关系。

1资料与方法

1.1标本来源选择2007—2010年上海中医药大学附属曙光医院手术切除的HCC组织及相应癌旁组织，并根据WHO病理分类进行病理复读和分类。组织标本的获取和保管按照上海医药大学曙光医院普外科手术样本获取标准操作规程(SOP)的要求进行。所有组织样本均在切除后立即置于液氮中。入选患者术前未接受化疗及其他抗癌治疗。共入选60例患者，年龄45～79岁；其中男性39例，女性21例。本研究经上海中医药大学附属曙光医院伦理委员会批准，患者或其家属均在手术前签署知情同意书。

1.2实时荧光定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)法检测miR-148b表达水平采用Trizol试剂盒(美国Invitrogen公司)，从HCC组织及癌旁组织中提取总RNA。应用TaqMan miRNA分析仪(美国Applied Biosystems公司)，采用miR-148b和U6内参基因特异的引物，从总RNA逆转录合成cDNA。应用ABI 7500系统(美国Applied Biosystems公司)进行RT-qPCR，检测miR-148b和U6内参基因的表达，均重复3次。miR-148b相对表达量采用公式2-ΔΔCt计算，以U6为内参进行标准化处理。采用SDS2.2.2软件(美国Applied Biosystems公司)分析结果。

1.3miR-148b与HCC临床病理指标的关系根据患者的病例资料，分析miR-148b与HCC患者年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤TNM分期、血管浸润、分化程度、甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)水平等临床病理指标的关系。

1.4统计学处理采用SPSS 20.0软件进行统计学分析，HCC与癌旁组织miR-148b表达的比较采用t检验。miR-148b表达和临床病理指标关系的分析采用Mann-Whitney U检验或Kruskal-Wallis检验。采用Kaplan-Meier法进行生存曲线分析，采用对数秩和检验(Log-rank)法进行生存分布的分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1miR-148b的表达水平比较RT-qPCR检测结果表明，HCC组织中miR-148 b相对表达水平为1.33±0.29，低于癌旁组织(1.92±0.30)，差异有统计学意义(P<0.01)。

2.2HCC临床病理指标与miR-148b表达水平的相关性分析根据HCC组织中的miR-148b表达水平(均数-标准差=1.62)将60例分为miR-148 b低表达组(表达水平<1.62，n=32)与高表达组(表达水平≥1.62，n=28)。miR-148 b表达水平与肿瘤TNM分期、血管侵犯及血清AFP水平均密切相关(P<0.01)。但2组在性别、年龄、肿瘤大小、有无卫星病灶、分化程度、合并疾病方面差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1　HCC组织中miR-148b表达水平与HCC临床病理指标的相关性分析　(n，%)

续表1

2.3miR-148b表达降低与预后不良有关60例患者随访时间为28～71个月，其中37例(61.7%)患者死亡，中位生存期为37个月。Kaplan-Meier生存分析以及对数秩和检验表明，miR-148b的表达情况与HCC患者的生存时间密切相关。miR-148b低表达组总生存时间短于高表达组(P<0.01)，其中低表达组中位生存时间为31个月[95%可信区间(CI)：

22～40]，而高表达组为46个月(95%CI：40～53) ，见图1。低表达组死亡未调整风险比(hazard ratio，HR)是高表达组的2.78倍(95%CI：1.19～6.55，P<0.05)。此外，HCC患者的生存时间还与肿瘤大小、TNM分期以及血管侵犯有关。但是，性别、年龄、组织分化、肝硬化、乙肝病毒感染或血清AFP水平对HCC患者的整体生存率没有预测价值。见表2。

图1　miR-148b表达水平与HCC患者预后的关系

项目HR值95%CIP值性别(男性/女性)1.2170.671~2.1250.659年龄(<60岁/≥60岁)1.1150.681~2.3430.869肿瘤直径(<5cm/≥5cm)4.4531.154~14.8070.043组织分化程度(低分化/高、中分化)1.4130.487~4.0980.524血管浸润(无/有)5.5841.695~17.6100.034TNM分期(Ⅰ/Ⅱ~Ⅲ)4.9831.254~18.1670.033miR-148b表达(高/低)2.7861.188~6.5530.019血清AFP水平(<20ng/mL/≥20ng/mL)0.5810.285~1.1660.106肝硬化(无/有)0.8350.393~1.7770.641病毒感染(无/有)3.1251.206~13.5800.885

3讨论

本研究率先在国内报道了miR-148b在中国HCC患者癌组织及癌旁组织中的表达情况，并发现miR-148b表达降低与患者预后差有关，提示miR-148b表达水平有可能成为判断HCC患者预后的指标，miR-148b有望成为治疗HCC的新靶点。

miR-148b定位于12q13.13。一般认为，miR-148b在恶性肿瘤组织中低表达，并且体外转染miR-148b具有抑制肿瘤增殖的作用。但是，也有研究[13]发现，miR-148b在卵巢癌中表达增加，显示出miR-148b的组织特异性。目前，关于miR-148b在HCC组织中的表达尚未有报道。在HCC细胞水平的研究[14]显示，与正常肝细胞相比，miR-148b表达水平在HCC细胞株(HepG2、MHCC97L和MHCC97H)中下调，提示miR-148b可能有一定的抑癌作用，但是关于人HCC组织与癌旁组织中miR-148b表达水平的相关比较研究，目前尚不多见。

本研究通过RT-qPCR方法比较了60例人HCC组织和相应癌旁组织中miR-148b的表达水平，并研究了miR-148b表达与HCC患者临床病理指标的关系。结果发现，miR-148b在HCC组织中表达水平低于癌旁组织。进一步分析miR-148b异常表达与临床病理指标的关系，结果显示，低表达的miR-148b与HCC血管侵犯和TNM分期有关，提示miR-148b低表达与HCC进展期病理特征有关。

Kaplan-Meier生存分析以及对数秩和检验表明，miR-148b低表达组与高表达组相比，患者整体生存率更差。低表达组死亡未调整HR值是高表达组的2.78倍，提示miR-148b表达降低与预后差有关。

miRNAs常通过控制多个靶点mRNA并改变其生物功能而影响肿瘤进展[15]。此外，miRNA在不同组织中发挥的生物学效应也可能存在差异。因此，miR-148b在HCC细胞中的表达调控可能具有其独特性。另外，由于本组病例是回顾性随访，并未对循环血液中的miR-148b水平进行测定，无法分析循环中miR-148b水平与HCC患者预后之间的关系，有待进一步研究。

总之，miR-148b作为一个具有肿瘤抑制作用的miRNAs在人HCC的生成以及恶化中发挥了重要作用。

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Expression of MicroRNA-148b in Hepatocellular Carcinoma Tissue and Its Clinical Significance

HAOYuqing1JIANGXuwei1XUYuzhen2

1.DepartmentofGeneralSurgery,BaoshanHospitalofIntegratedChineseandWesternMedicine,Shanghai201900,China; 2.DepartmentofGastrointestinalSurgery,XuzhouCentralHospital,Xuzhou221009,China

AbstractObjective：To investigate the relationship between the expression of microRNA-148b(miR-148b) in human hepatocellular carcinoma (HCC) and the prognosis of HCC. Methods:The specimens of HCC tissue and para-carcinoma tissue acquired by surgical resection during 2007 and 2010 were collected from frozen tissue specimen library of Shuguang Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine. The expression of miR-148b in tissue specimen was detected by real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR).The clinical significance of expression change of miR-148b was analyzed by considering the clinical pathological indicators and survival data. Results: The expression level of miR-148b in HCC was significantly lower than that in para-tumor tissues(P<0.01). Low expression of miR-148b was associated with HCC malignant clinical pathological indicators such as vascular invasion and TNM stage.Kaplan-Meier survival curve analysis showed that the patients with low expression of miR-148b had poor overall survival rate. Conclusions: The expression of miR-148b decreases in human HCC tissue. And it is associated with the poor clinical prognosis.

Key WordsHepatocellular carcinoma；microRNA-148b；Overall survival；Prognosis

中图分类号R 735.7

文献标识码A