老年巨幼细胞性贫血患者同型半胱氨酸与T淋巴细胞亚群的相关性研究

沈继春，张爱民，刘冀琴，刘晓梅

(武装警察部队后勤学院附属医院 a.血液科，b.检验科，天津 300162)



老年巨幼细胞性贫血患者同型半胱氨酸与T淋巴细胞亚群的相关性研究

沈继春a※，张爱民b，刘冀琴b，刘晓梅b

(武装警察部队后勤学院附属医院 a.血液科，b.检验科，天津 300162)

目的 探讨老年巨幼细胞性贫血(MA)患者血清同型半胱氨酸(Hcy)水平与T淋巴细胞亚群的相关性。方法 选取2012年1月至2014年12月武装警察部队后勤学院附属医院收治的MA患者150例，根据血红蛋白(Hb)水平分为轻度贫血组(73例，90 g/L≤Hb<110 g/L)和中度贫血组(77例，60 g/L≤Hb<90 g/L)。选择同期健康体检者150例作为对照组。检测各组受试者Hb、Hcy、维生素B12、叶酸的水平以及CD3+T、辅助性T细胞(Th)、抑制性T细胞(Ts)比例和Th/Ts比值。结果 轻度贫血组和中度贫血组的Hcy水平[(19.4±2.6) μmol/L和(29.3±6.9) μmol/L]与对照组[(9.6±5.3) μmol/L]相比，显著升高(P<0.05)，而Hb、维生素B12、叶酸水平显著降低(P<0.05)。与轻度贫血组相比中度贫血组变化幅度较大(P<0.05)。MA组的CD3+T[(59.2±2.6)%]、Ts[(16.9±2.8)%]与对照组[(67.2±3.7)%、(23.4±3.0)%]相比，其比例显著降低(P<0.01)，而Th、Th/Ts显著升高(P<0.01)。MA组患者Hcy与维生素B12和叶酸均呈负相关(r=-0.402，-0.437，P<0.05)；Hcy与CD3+T、Ts比例呈负相关(r=-0.610，-0.514，P<0.05)，而与Th比例及Th/Ts呈正相关(r=0.479，0.515，P<0.05)。结论 老年MA患者血清中高Hcy与机体免疫功能异常具有相关性，并可作为临床诊断及评估病情的一项参考指标。

巨幼细胞性贫血；同型半胱氨酸；T淋巴细胞亚群

巨幼细胞性贫血(megaloblastic anemia,MA)是由于叶酸和(或)维生素B12缺乏而影响细胞内DNA的代谢，骨髓中出现幼稚红细胞，伴巨幼样变，发生髓内溶血引起的一种良性贫血，多见于老年人。叶酸是同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)代谢的重要一碳单位供体，维生素B12又是Hcy代谢的重要辅酶，两者的缺乏会引起体内Hcy的堆积，进而产生一系列损伤，并影响机体的免疫功能。而T淋巴细胞亚群[包括辅助性T细胞(helper T cell，Th细胞或CD4+T细胞)和抑制性T细胞(suppressor T cell，Ts细胞或CD8+T细胞)]在体液免疫及细胞免疫中均发挥重要作用。因此，本研究主要探讨老年MA患者Hcy及T淋巴细胞亚群的改变，并研究两者的相关性，为临床MA的诊断及病情评估提供参考依据，进而为老年MA的治疗提供临床证据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2012年1月至2014年12月武装警察部队后勤学院附属医院收治的MA患者150例(MA组)，其中男79例、女71例，年龄61～79岁，中位年龄70岁。上述患者根据血红蛋白(hemoglobin，Hb)水平分为轻度贫血组73例(90 g/L≤Hb<110 g/L)和中度贫血组77例(60 g/L≤Hb<90 g/L)。其中，轻度贫血组73例，男39例、女34例，年龄61～68岁，中位年龄72岁；中度贫血组77例，男40例、女37例，年龄67～79岁，中位年龄74岁。上述病例的诊断均符合《血液病诊断及疗效标准》[1]。选择同期健康体检者150例作为对照组，其中男75例、女75例，年龄60～77岁，中位年龄68岁。排除标准：心脑血管疾病及严重肝肾功能障碍的患者，且至少1个月内服用叶酸、维生素B12及可能影响叶酸、维生素B12吸收药物的患者。各组受试者的性别、年龄等一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究受试者均签署知情同意书，并由医院伦理委员会批准实施。

1.2 方法 分别检测 Hb、血清Hcy、维生素B12、叶酸的水平，以及CD3+T、Th、Ts细胞比例和Th/Ts比值。

1.2.1 Hb水平的检测 采集空腹静脉血2 mL置于乙二胺四乙酸抗凝管中，采用日本Sysmex-XE-2000检测。

1.2.2 Hcy、维生素B12、叶酸的检测 采集空腹静脉血2 mL，离心半径10 cm，3000 r/mim离心5 min，取血清，并于2 h 内检测。采用美国雅培ARCHITECTI4000全自动免疫分析仪及其配套试剂盒，所有操作均严格按照操作说明书执行。

1.2.3 T细胞亚群的检测 采集空腹静脉血2 mL置于乙二胺四乙酸抗凝管中，取25 μL样本与5 μL光孵育30 min后，加入1 mL稀释后的破红液混匀，避光静置8 min，离心半径10 cm，1200 r/min离心5 min，弃上清，加入300 μL磷酸缓冲液充分混匀后，采用美国BD公司FACSCan to Ⅱ全自动流式细胞分析仪进行检测，所有操作严格按照操作说明书执行。

2 结 果

2.1 各组受试者Hb、Hcy、维生素B12及叶酸水平的比较 与对照组相比，轻度贫血组和中度贫血组Hcy水平显著升高(P<0.05)，而Hb、维生素B12、叶酸水平显著降低(P<0.05)；与轻度贫血组相比，中度贫血组Hcy显著升高(P<0.05)，血Hb、维生素B12、叶酸水平显著降低(P<0.05)。见表1。

组别例数Hb(g/L)Hcy(μmol/L)维生素B12(ng/L)叶酸(μg/L)对照组 150127±109.6±5.3439±3015.3±4.3轻度贫血组7394±4a19.4±2.6a167±22a5.6±1.8a中度贫血组7774±5ab29.3±6.9ab100±28ab2.9±1.0abF30.54101.16454.78112.19P0.0000.0000.0000.000

Hb:血红蛋白；Hcy:同型半胱氨酸；对照组：健康体检者；a与对照组比较，P<0.05；b与轻度贫血组比较，P<0.05

2.2 MA组患者Hcy与维生素B12和叶酸水平的相关性分析 Hcy与维生素B12和叶酸水平均呈负相关(r=-0.402，-0.437，P<0.05)。

2.3 MA组和对照组T淋巴细胞亚群测定值的比较 与对照组相比，MA组CD3+T细胞比例、Ts比例显著降低(P<0.01)，而Th比例、Th/Ts显著升高(P<0.01)，见表2。

组别例数CD3+(%)Th(%)Ts(%)Th/TsMA组15059.2±2.647±316.9±2.84.26±2.40对照组15067.2±3.732±323.4±3.01.92±0.11t21.56040.62019.52111.929P0.0000.0000.0000.000

MA：巨幼细胞性贫血；Th:辅助性T细胞；Ts:抑制性T细胞；对照组：健康体检者

2.4 MA组患者Hcy与T淋巴细胞亚群的相关性分析 Hcy与CD3+T细胞比例、Ts比例呈负相关(r=-0.610，-0.514，P<0.05)，而与Th比例及Th/Ts呈正相关(r=0.479，0.515，P<0.05)。

3 讨 论

随着老龄化社会的来临，带病生存的老年患者逐渐增多，巨幼细胞性贫血的发病率也逐年上升。老年人由于饮食习惯或胃肠道功能降低，致使叶酸和维生素B12摄入不足或吸收障碍，往往容易出现MA。本研究结果显示，与对照组相比，轻度贫血组和中度贫血组维生素B12、叶酸水平均降低(P<0.05)；与轻度贫血组相比，中度贫血组维生素B12、叶酸水平显著降低(P<0.05)。另外，MA患者除有贫血、消化道症状及神经系统症状外，还可能存在免疫功能异常，从而引起相关疾病的发生。人体正常的免疫系统依赖于各种免疫细胞的协调稳定，T淋巴细胞既是体液免疫的主要细胞，又可以介导并调节体液免疫。T淋巴细胞均特异性表达CD3分子，其中，Th细胞可以辅助并诱导其他免疫相关细胞发挥相应的功能，也可引起迟发型超敏反应；而Ts细胞则以直接或间接的方式杀灭表达特异性抗原的Th细胞、B细胞和肿瘤细胞，还可分泌多种细胞因子抑制免疫反应。Th/Ts 一般相对稳定，可以反映人体细胞免疫状态，若两者数目或Th/Ts 比值发生改变，机体免疫功能也可能发生变化[2]。近年来，研究发现很多血液疾病伴随T淋巴细胞的异常。Nakamura等[3]研究发现，骨髓增生异常综合征患者存在免疫功能的异常，主要表现为T淋巴细胞过度活化，其中以Th细胞异常为主。Erkurt等[4]发现，维生素B12缺乏患者体内的Th、Ts细胞均降低，而Ts细胞降低更显著，Th/Ts比值增高，自然杀伤细胞功能受抑制。有研究发现，MA患者免疫功能异常，表现为Ts细胞显著降低，Th/Ts比例显著升高[5]。本研究结果显示，与对照组相比，MA组CD3+T细胞比例、Ts比例显著降低(P<0.01)，而Th比例、Th/Ts显著升高(P<0.01)。因机体的免疫反应有众多免疫细胞及细胞因子的参与，且处在动态平衡中，T淋巴细胞的改变可能影响整体的免疫功能，所以MA患者T淋巴细胞亚群发生变化，可能存在免疫功能的紊乱，而此病理过程是否有其他因素的作用尚有待研究。

Hcy为甲硫氨酸循环的一个中间代谢产物，而叶酸和维生素B12是Hcy再甲基化的一碳单位供体和辅酶。因此，叶酸和(或)维生素B12的缺乏会导致Hcy代谢障碍。本研究也验证了Hcy与维生素B12和叶酸呈负相关(P<0.05)。且MA患者血清Hcy较对照组显著升高，中度贫血组升高更显著，提示血清Hcy可作为评估MA患者贫血程度的参考指标。目前，高Hcy已被证实是心脑血管疾病的危险因素[6-7]，它参与氧化应激、内质网应激及炎症反应[8]等诸多方面。近年来研究发现[9-10]，在高血压、恶性肿瘤等许多疾病中，Hcy与免疫功能的异常有相关性。本研究亦证实，在MA患者中Hcy与CD3+T细胞比例、Ts比例呈负相关(P<0.05)，而与Th比例、Th/Ts呈正相关(P<0.05)。这种相关性可能与Hcy激活核因子κB，引起单核细胞趋化蛋白1[11]、肿瘤坏死因子α、白细胞介素6、白细胞介素1β、白细胞介素8等炎性因子的释放，造成DNA损伤及影响细胞周期[12]等有关。而具体Hcy如何激活或抑制淋巴细胞的变化及其内部的信号转导通路有待基础科学的进一步研究。

综上所述，与对照组相比，MA患者Hcy明显升高，而维生素B12、叶酸水平明显下降，且中度贫血MA患者与轻度贫血MA患者相比，变化幅度大，提示Hcy可作为评价MA及其贫血程度的参考指标。同时，MA患者存在细胞免疫功能的异常，而Hcy与T淋巴细胞亚群的变化具有相关性。因此，降低血清Hcy水平可能改善MA患者的免疫功能，进而改善患者的预后。

[1] 张之南,沈悌.血液病诊断及疗效标准[S].北京:科学出版社,2007:12-16.

[2] Yasutomo K.The cellular and molecular mechanism of CD4/CD8lineage commitment [J].J Med Invest,2002，49(1/2):1-6.

[3] Nakamura Y,Yasuoka H,Tsujimoto M,etal.Importance of lymph vessels in gastric cancer:8 prognostic indicator in general and a predictor for lymph node metastasis in early stage cancer[J].J Clin Pathol,2006,59(1):77-82.

[4] Erkurt MA,Aydogdu I,DikilitaM,etal.Effects of cyanocobalamin on immunity in patients with pernicious anemia[J].Med Princ Pract,2008,17(2):131-135.

[5] Gogos CA,Kapatais-Zoumbos KN,Zoumbos NC.Lymphocyte subpopulations in megaloblastic anaemia due to vitamin B12deficiency[J].Scand J Haematol,1986,37(4):316-318.

[6] Eikelboom JW,Hankey GJ,Anard SS,etal.Association between high homocysteine and ischemic stroke due to large-and small-artery disease but not other etiologic subtype of ischemic stroke[J].Stroke,2000,31(5):1069-1075.

[7] Fowler B.Homocystein-an independent risk factor for cardiovascular and thrombotic diseases[J].Ther Umsch,2005,62(9):641-

646.

[8] Au-Yeung KK,Woo CW,Sung FL,etal.Hyperhomocysteinemia activates nuclear factor-kappaB in endothelial cells via oxidative stress[J].Circ Res,2004, 94(1):28-36.

[9] 赫连曼,王浩,赵海鹰,等.原发性高血压患者血同型半胱氨酸与24小时血压变异性的关系[J].临床荟萃,2015,30(2):185-187.

[10] Koaar I，Kumar J，Thakur N，etal.Homocysteine levels are associated with cervical cancer independent of methylene letrahydrofolate reductase gene(MTHFR) polymorphisms in Indian population[J].Biomarkers,2010,15(1):61-68.

[11] Song YS,Rosenfeld ME.Methionine-induced hyperhomocysteinemia promotes superoxide anion generation and NFkappaB activation in peritoneal macrophages of C57BL/6 mice[J].J Med Food,2004,7(2):229-234.

[12] Picerno I,Chirico C,Condello S,etal.Homocysteine induces DNA damage and alterations in proliferative capacity of T-lymphocytes:a model for immunosenescence?[J].Biogerontology,2007,8(2):111-119.

Study on Clinical Significance of Homocysteine Examination in Elder Patients with Megaloblastic Anemia and Its Relationship with Changes of T Lymphocyte Subgroup

SHENJi-Chuna,ZHANGAi-minb,LIUJi-qinb,LIUXiao-Meib.

(a.DepartmentofHematology，b.DepartmentofClinicalLaboratory,AffiliatedHospitalofLogisticsUniversityofChinesePeople′sArmedPoliceForce,Tianjin300162，China)

Objective To observe the relationship of changes of homocysteine and T lymphocyte subgroup in elder patients with megaloblastic anemia(MA).Methods A total of 150 patients diagnosed as MA admitted to the Affiliated Hospital of Logistics University of Chinese People′s Armed Police Force during Jan.2012 and Dec.2014 were divided into two groups according to hemoglobin(Hb) level:light anemia (73 cases，90 g/L≤Hb<110 g/L) and moderate anemia(77 cases，60 g/L≤Hb<90 g/L).Another 150 healthy people for physical examination during the same period in the hospital were selected as the control group.And the Hb,Hcy,cyanocobalamin (Vit B12), folic acid and percentage of CD3+T,Th,Ts and Th/Ts were observed and analyzed.Results Hcy level of mild anemia group[(19.4±2.6) μmol/L] and moderate anemia group[(29.3±6.9) μmol/L ]were significantly higher than the control group[ (9.6±5.3) μmol/L] (P<0.05),while Hb,Vit B12,folic acid were lower in MA group than the control group(P<0.05).And similar kind changes were found in moderate anemia subgroup when compared to light anemia group(P<0.05).Moreover,the percentage of CD3+T cell[(59.2±2.6)%] and Ts [(16.9±2.8)%] of mild anemia group and moderate anemia group were lower than control group [(67.2±3.7)% and (23.4±3.0)%] (P<0.01),and the percentage of Th cell and the rate of Th/Ts were increased in MA group(P<0.01).Hcy and Vit B12and folic acid of MA group were positively correlated(r=-0.402，-0.437，P<0.05).Hcy were negatively correlated with CD3+T,Ts percentage(r=-0.610，-0.514，P<0.05),and positively correlated with Th and Th/Ts(r=0.479，0.515，P<0.05).Conclusion The higher level of Hcy relates to the immune abnormality in elder patients with MA and may be an potential predictor to the diagnosis and prognosis.

Megaloblastic anemia； Homocysteine； T lymphocyte subgroup

R556

A

1006-2084(2015)12-2247-03

10.3969/j.issn.1006-2084.2015.12.051

2015-02-24

2015-04-03 编辑：伊姗