人脐带间充质干细胞的生物学特征及在妇产科中的研究进展

冯 春,冯 磊,梁素丽,曹 宁,么福勤,闫杰培,王 琪,李 杨,郑 引(综述),郭 镭(审校)

(1.圣释(北京)生物工程有限公司 SCLGL圣释再生医学实验室， 北京 100018; 2.吉林大学中日联谊医院肝胆胰外科,长春 130033)



人脐带间充质干细胞的生物学特征及在妇产科中的研究进展

冯 春1,冯 磊1,梁素丽1,曹 宁1,么福勤1,闫杰培1,王 琪1,李 杨1,郑 引1(综述),郭 镭2※(审校)

(1.圣释(北京)生物工程有限公司 SCLGL圣释再生医学实验室， 北京 100018; 2.吉林大学中日联谊医院肝胆胰外科,长春 130033)

间充质干细胞来源于发育早期中胚层的多能干细胞，具有高度多能性和可塑性，通过特定条件的体外定向增殖、分化培养，可获得包括成软骨细胞、脂肪细胞、神经细胞等在内的多种体细胞。脐间充质干细胞来源于相对纯净的新生儿脐带组织，具有成本较低、不涉及伦理问题且不损害供者等优势，为组织细胞工程在临床妇产科学的广泛应用提供了新的思路。

间充质干细胞；妇产科；生物学特征；应用前景

间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)是目前实验和临床研究最多的成体多能干细胞,在造血干细胞移植、移植物抗宿主病等中具有重要应用。根据来源可分为骨髓来源MSC(bone marrow MSC，BMSC)、脂肪来源MSC和脐带来源MSC(human umbilical cord MSC，hUCMSCs)[1]。目前研究最为深入广泛的是BMSC，但由于当前人骨髓来源BMSC水平极低，且存在病毒感染率较高、细胞增殖分化潜能随年龄的增大而下降且穿刺取材是一个侵袭性、有创伤、易污染的操作，对其临床广泛应用带来限制。研究发现从人脐带中分离出的hUCMSCs，在细胞含量、增殖能力均优于BMSC，多次传代扩增仍能保持旺盛功能，不表达或低表达免疫排斥相关标记，免疫原性比BMSC低[2]，且取材方便，无伦理学争议，是目前认为较为理想的种子细胞。现对人脐带间充质干细胞的生物学特征及在妇产科中的研究进展予以综述。

1 hUCMSCs分离及培养

目前，研究者们尝试不同的方法进行hUCMSCs的分离、培养，主要应用酶消化法和组织块贴壁培养法。酶消化法是将小块脐带，在包含透明质酸酶和胶原酶的酶液混合物中进行0.5～16 h的消化处理。Wang等[3]取人脐带组织除脐血管后，消化处理16 h，3 d后可见成纤维样细胞生长，传代后细胞形态稳定。Weiss等[4]用酶处理细胞后，传代培养后每厘米脐带可获得15 000～17 000 个细胞。分离后的细胞贴壁生长，消化后的悬浮细胞在换液的过程中逐渐被除去，24 h后可见铺路石样细胞和成纤维样细胞，成纤维样细胞即为MSC前体细胞。体外培养hUCMSCs能快速增殖，传10代以上细胞可增加5～10倍且细胞增殖速度无明显降低，体外增殖能力较强；组织块贴壁法步骤相对简便，完全培养基中培养小块脐带组织，10～14 d后即获得较为纯化的细胞。Romanov等[5]首先采用hUCMSC组织培养方法，从人脐静脉内分离到具有端粒酶活性和表达干细胞因子受体C-kit 类似BMSC的细胞。相比较而言，酶消化法在培养过程中混有多种细胞，须进行技术层面要求高的细胞标记，然后再分离纯化，培养过程中不能排除污染和损伤，贴壁法则操作简单，细胞生物学特征更稳定，污染机会少。

2 hUCMSCs生物学特性

MSC目前研究较多，仍无特异性判定标准。基本通过细胞形态、增殖分化特点、免疫表型等来判断。

2.1 增殖特征 hUCMSCs分离培养24 h后，显微镜下可见贴壁、均一的梭形细胞和多角形细胞。传代后培养2～3 d即进入对数生长期，此时细胞膜粗糙呈不规则圆形，胞核位于中央、体积较大，核仁明显，多次传代后，细胞的核型保持稳定，旋涡状生长。持续3～4 d后进入生长平台期。研究表明12代以内的细胞代间无增殖能力差异，增殖能力较强,见图1、2(图片来源-SCLGL圣释再生医学实验室)。

图1 脐带来源间充质干细胞细胞形态(×40)

图2 脐带来源间充质干细胞HE染色(×200)

2.2 免疫表型 国际干细胞协会规定hUCMSCs应至少达到如下标准[6]：表达CD13、CD44、CD29及CD105，对C-kit、CD14、CD11b、CD45、CD34、CD19、CD79和人类白细胞抗原-外源性抗原的呈递分子(human leukoyte antigen DR,HLA-DR)抗原不表达。Karahuseyinoglu等[7]研究表明，hUCMSCs在表达

CD44、CD13、CD29、CD105的基础上还表达CD10、CD73、CD49、CD166、CD90、CD146；而对CD14、CD34、CD56、CD45等不表达，对主要组织相容性复合体Ⅰ类分子低水平表达， 对主要组织相容性复合体Ⅱ类分子不表达，使同体CD4+T细胞不能识别MSC，从而逃脱了CD4+T细胞的免疫监视从而在异体甚至异种体内长期存活。张浪辉等[8]用流式细胞仪检测分析hUCMSCs：传代细胞间免疫表型符合国际干细胞协会标准(CD13、CD44、CD105和CD29均强表达)，对CD106弱表达，对HLA-Ⅰ弱表达或不表达；不表达HLA-Ⅱ抗原和CD45、CD14、CD31、CD34。以上研究均肯定hUCMSCs具有干细胞特性。除此之外，CD73，CD95等也可作为hUCMSCs的细胞表型标志，见图3。SCLGL圣释再生医学实验室的hUCMSCs多能性检测显示，此类细胞通常表达与胚胎干细胞类似的多能性基因如OCT-4、Nanog、Sox-2、SSEA-4、Vimitin等，见图4(封三)。

人脐带间充质干细胞的生物学特征及在妇产科中的研究进展

图4 脐带来源间充质干细胞免疫荧光染色 4A：SOX-2基因表达(×4);4B:SSEA-4基因表达(×10)；4C：OCT-4基因表达(×4)；4D：Nanog基因表达(×4)

图3 hUSMSCs细胞表面标志物 流式检测结果显示hUSMSCs高表达CD44、CD73、CD90、CD95、CD105、HLA-ABC，低表达或不表达CD34、CD45、HLA-DR；3A：CD34；3B：CD45；3C：CD44；3D：CD73；3E：CD90；3F：CD95；3G：CD105；3H：HLA-ABC;3I:HLA-DR;hUSMSCs:脐带血来源间充质干细胞；FITC：异硫氯酸荧光素；HLA-DR：人类白细胞抗原-外源性抗原的呈递分子；HLA-ABC：人类白细胞ABC抗原

2.3 多分化潜能和细胞因子表达 hUCMSCs相比于BMSC更接近胚胎干细胞，具有更大的分化潜能。经体外诱导后，hUCMSCs既可以分化为中胚层来源的多种组织细胞，又可以分化为内胚层来源的肝细胞样细胞和外胚层来源神经元样细胞。伴有多种细胞特异性标志物，显示细胞特征性结构[9-10]。Baksh等[11]体外诱导hUCMSCs时发现，细胞内有脂肪小滴出现。Wang等[2]研究发现，hUCMSCs经诱导14 d后，细胞形态发生改变，伴有脂滴和成骨样组织钙结节表达。另外，还发现骨桥蛋白(osteopontin)、成骨细胞特异性的缝隙连接蛋白43以及调控MSC向成骨细胞分化的特异性转录因子(Runt-related transcription factor，RUNX)的细胞内表达，表明hUCMSCs呈现典型的脂肪样细胞和成骨样细胞分化。在向成骨细胞诱导时，hUCMSCs内碱性磷酸酶高表达、产生骨涎蛋白并形成钙结节[12]。周佳等[13]和何红燕等[14]利用微团块成软骨诱导法发现软骨特异性的陷窝样结构软骨细胞及尼氏小体样等结构并释放神经元特异性烯醇化酶。此外，有实验证明hUCMSCs具有向胰岛样细胞分化的潜能[15]。虽然hUCMSCs具有多向分化的潜能, 但仍需深入系统研究，以为临床应用提供可靠依据。

3 hUCMSCs应用进展

hUCMSCs作为种子细胞，因其增殖特征和多分化潜能修复或代替多种病变组织，为暂时难治愈的疾病提供了可行性、安全性的治疗方案，在多个器官、系统均有广泛研究，特别在妇产生殖方面受到广泛关注。

3.1 卵巢早衰 卵巢早衰是指妇女40岁前，引发的闭经、体内激素缺乏或紊乱而致不孕的疾病。在国外，普通人群卵巢早衰发病率约为1%[16]，中国约3.8%，其中特发性卵巢早衰约占80%[17]。卵巢早衰的病因包括染色体异常、酶缺陷、及医源性因素等。当前受自然、社会因素影响，肿瘤发病率逐年升高，且呈年轻化趋势，在肿瘤治疗过程中各种化疗药物的使用而导致妇女卵巢早衰的病例越来越多，通常表现为情绪失控、内分泌失调而致不孕。当前如何预防卵巢早衰、修复受损卵巢是研究人员努力方向。

李彩霞等[18]通过化疗损伤小鼠卵巢早衰动物模型进行hUSMSCs尾静脉移植，发现其定向卵巢部位归巢的能力。目前采用多种方法预防和治疗化疗所致卵巢早衰，如激素替代疗法和辅助生殖技术。应用激素替代疗法在缓解患者生理状态的同时，可以改善由内分泌紊乱引起的症状，使极少数患者在短时间恢复排卵，但长期应用激素替代疗法有增加乳腺癌、心脏病和中风风险的担忧[19]。

胚胎移植和激素替代周期的卵子赠送是目前有效的治疗方式。Lutjen等[20]报道世界首例卵巢早衰妇女通过该技术成功生育。虽然能够有效解决生育问题，但是该技术存在伦理和法律上的争议，所以寻求恢复患者自身的卵巢功能的方法才是最理想的治疗途径。

研究发现，大鼠MSC卵巢局部移植能修复卵巢结构、改善内分泌功能，对化疗所致的卵巢早衰有明显效果[21]。Kang等[22]研究表明，鼠诱导性多能干细胞与卵巢颗粒细胞共培养后，刺激表达卵泡刺激素受体的颗粒细胞超过90%，且E2浓度明显上升，且在7 d内呈正相关。Liu等[23]将经红色荧光蛋白转导的CD44+/CD105+的羊水MSC在体外培养扩增后移植入环磷酰胺诱导的卵巢早衰小鼠卵巢内3周，标记细胞仍可探测，说明标记细胞的增殖。党建红等[24]研究发现，脐血MSC移植入放疗引起卵巢早衰的裸鼠卵巢内可使E2上升及黄体生成素、促卵泡素下降，未闭锁卵泡数增加并可见各个发育阶段卵泡。朱少芳[25]发现hUSMSCs能部分修复环磷酰胺导致的大鼠卵巢早衰，改善卵巢的内分泌功能，修复卵巢损伤。对比卵巢早衰大鼠卵巢和尾静脉注射MSC的效果，前组大鼠的促卵泡激素恢复较快，生育幼仔早，而静脉注射更为微创，损伤更少，并可以多次注射提高细胞浓度，有望成为卵巢早衰替代的治疗方式。

3.2 妇科肿瘤 卵巢癌是妇科肿瘤中病死率居于首位的恶性肿瘤，以肿瘤细胞的过度增殖、转移及侵袭为主要特征。目前常规的治疗手段难以明显提高患者，尤其是晚期患者的远期生存率，生物防治是继手术、放化疗后第4种肿瘤治疗模式，逐渐成为治疗的新热点，包括肿瘤免疫和基因治疗。MSC逐渐显示出作为抗肿瘤基因载体系极好的应用前景。赵雯红等[26]将抗肿瘤细胞因子白细胞介素12结合hUCMSCs重组腺病毒载体(AdIL-12-MSC)，研究发现重组的AdIL-12-MSC通过表达白细胞介素12基因，显著抑制SKOV3 细胞的增殖并诱导其凋亡，并抑制卵巢癌在裸鼠体内的生长。此研究提示hUCMSCs作为抗肿瘤基因治疗负载体系具有可行性。

3.3 免疫调控 English等[27]在研究MSC抑制免疫排斥反应的机制中证实，MSC可以从多层次对免疫反应进行调控。MSC的抗凋亡效应与抑制炎性因子肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β的产生密切相关，MSC对B细胞、T细胞、自然杀伤细胞等的激活和增殖具有抑制作用。MSC进入机体优势分布于受损部位，促进其恢复原有功能。将羊膜及绒毛膜来源的MSC利用其低免疫原性与人外周单个核细胞及猪外周单个核细胞共培养，细胞并无刺激增殖现象的产生，并以间接接触方式抑制同种异体淋巴细胞混合反应。胎盘MSC与异体外周单个核细胞共培养，同样细胞并无刺激增殖现象的产生淋巴细胞混合反应，抑制效应与细胞数量有正相关趋势。MSC在为其他细胞增殖分化提供良好的微环境的同时，并无直接参与器官、组织修复再生。因此，MSC进入机体后是否可以定向分化并准确进入靶部位；能否引发急性免疫排斥反应等问题就显得尤为重要。

3.4 修复子宫内膜 MSC可以分化为子宫内膜上皮样，成纤维样及蜕膜成纤维样间质细胞，当MSC迁移至子宫内膜受损处，通过旁观者效应机制对原有受损靶细胞优先刺激并进行修复处理，并非增殖、分化为受损靶细胞后再进行靶组织功能修复。此修复机制表明，外源性的MSC经诱导分化后，在损伤发生急性期，会有更好的治疗效果。

4 结 语

近年来，干细胞替代治疗和基因治疗成为生命科学领域中的研究热点和前沿, 并证实在组织修复中发挥重要作用。hUCMSCs的研究已成为传统骨髓MSC的新生力量，虽然hUCMSCs的研究成果丰硕，但仍有许多问题阻碍在临床上正式应用。首先关于hUCMSCs的生物学特点并不完善，同其免疫表型间有不确定性，因此应控制并确认hUCMSCs的生物学稳定性。另外，MSC仍无明确标志物，主要是根据它的形态、功能等鉴定MSC，没有特异性标志物或复合标志物可供识别。其次细胞增殖、分化培养过程中会因培养试剂、细胞密度、添加生长因子等不同，造成同一来源干细胞再细胞表型、免疫表型、生物学特性等存在较大差异，进而影响其应用[28]。综上所述，hUCMSCs作为MSC的新生力量，随着其在组织、器官修复、细胞基因靶向治疗、免疫移植治疗等方面作用机制的不断完善，会有更广阔应用前景。

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Study on the Biological Characteristics of Human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells and Related Research Progress in Obstetrics and Gynecology

FENGChun1,FENGLei1,LIANGSu-li1,CAONing1,YAOFu-qin1,YANJie-pei1,WANGQi1,LIYang1,ZHENGYin1,GUOLei2.

(1.TheShengShi(Beijing)BiologicalEngineeringCo.,LtdSCLGLtheShengShiofregenerativemedicinelab,Beijing100018,China; 2.DepartmentofHepatopancreatobiliarySurgery,ChinaJapanUnionHospitalofJilinUniversity,Changchun130033,China)

Mesenchymal stem cells derives from multipotent stem cells of early development inmesoderm,with high degree of pluripotency and plasticity.Through culture in vitro under specific conditions,mesenchymal stem cells can proliferate and differentiate into a variety of somatic cells including cartilage cells,fat cells,nerve cells,etc.Human umbilical cord mesenchymal stem cells come from the relatively pure tissue of neonatal umbilical cord tissue,with the advantages of low cost and free from ethical issues and no damage to the provider,which provides a new approach for the wide application of tissue engineering in clinical obstetrics and gynecology.

Mesenchymal stem cells; Obstetrics and gynecology department; Biological characteristics; Application prospect

R711

A

1006-2084(2015)12-2133-04

10.3969/j.issn.1006-2084.2015.12.008

2014-09-01

2014-12-03 编辑：相丹峰