水提醇沉法提取半枝莲粗多糖中总糖含量的最佳工艺研究

纪耀华，赵 帅

(1长春医学高等专科学校，长春 130031;2 长春中医药大学研究生院，长春 130117)

半枝莲(Scutellaria barbata)为唇形科植物半枝莲的干燥全草［1］，被人们所认可的主要有效成分为黄酮类、多糖和挥发性物质［2］，其中，黄酮类化合物是从半枝莲中得到最多的一类成分，被认为是其主要的生理活性物质。在半枝莲的挥发性成分的研究方面，张福维等［3］曾采用蒸馏-萃取法从半枝莲中提取并鉴定出35 种挥发性成分化合物，包含了酮类、醛类、醇类、酚类、酸类、烯烃类、烷烃类等多种类化合物，占挥发油总量的87.45%，而同为半枝莲主要提取成分之一的半枝莲粗多糖由于其良好的抗肿瘤活性作用而在近些年备受关注。文献表明，机体为维持正常免疫功能调节作用需Th1 和Th2 亚群细胞因子相互抑制、相互转化，保持平衡，一旦两者失衡将导致疾病的发生。叶华［4］等通过文献查阅发现，结肠癌等多种肿瘤患者体内Th2 型细胞因子占优势，且Th1/Th2 的偏移与肿瘤的恶性程度呈正相关，并通过实验发现，半枝莲粗多糖能降低C26 结肠癌小鼠瘤重，有效纠正肿瘤所引起的Th1/Th2 失衡，增强机体抗肿瘤功能，改善免疫状态，进而起到治疗肿瘤的作用。李洁等［5］采用MTT 比色法检测不同浓度半枝莲含药血清对K562/A02 耐药株的逆转倍数，从而证明了半枝莲在一定程度上能够逆转肿瘤细胞的多药耐药性，使肿瘤细胞恢复对化疗药物的敏感性。宋高臣［6］等研究发现，半枝莲粗多糖能提高化疗药物的抑瘤率，提高单核吞噬细胞功能和IL-2、TNF-α 活性，并提出半枝莲粗多糖可能是通过增强机体的免疫功能实现对化疗药物的增效减毒作用。陈爱东［7］等利用人胃癌细胞裸鼠种植瘤模型，并通过ELISA 法检测模型外周血血清中P21 和VEGF 含量从而观察半枝莲粗多糖对胃癌小鼠体内肿瘤细胞生长的影响，发现半枝莲粗多糖在小鼠体内具有抑制胃癌小鼠模型癌细胞增殖和扩散的作用。于水澜［8］等通过研究发现，半枝莲粗多糖对肝癌的治疗是通过改变蛋白质表达，从而调节多靶点共同作用所致。张晶［9］等依据许多疾病与生物膜脂流动性有关，对S180 荷瘤小鼠红细胞膜进行多项检测并发现半枝莲粗多糖可改善其红细胞膜功能状态，提高膜的流动性，增强红细胞的免疫功能。近年实验研究者们还发现，半枝莲粗多糖具有清除自由基、抗衰老、调节免疫、影响蛋白质表达，对S180 肉瘤抑制作用等［10-12］。

本文通过传统水提醇沉方法下对半枝莲粗多糖中总糖含量最适高效提取方案进行探索，为半枝莲粗多糖适用于大规模生产提供参考。

1 设备与耗材

1.1 试验设备

U-1901 双光束紫外可见分光光度计(北京普西通用仪器责任有限公司)、电子天平CPA224S (赛多利斯科学仪器有限公司)。

1.2 药材与试剂

半枝莲(吉林省吉深医药实业有限公司)、分析纯级的苯酚、浓硫酸、乙醇;标准品:无水葡萄糖(飞宇生物科技有限公司，含量大于98%，批号:FY18720206)。

2 试验方法

2.1 半枝莲样品液的制备

半枝莲样品液的制备工艺流程如下:

2.2 提取条件因素水平设定

对提取时间、温度、料液比三个因素进行正交试验，设定如表1。

表1 正交试验因素水平

2.3 半枝莲粗多糖中总糖含量测定

2.3.1 标准品溶液的配制 精密称取干燥至恒重的无水葡萄糖0.0148g，用水溶解成浓度为148.1μg/mL 的溶液。

2.3.2 标准曲线的制备 依次精密吸取上述标准品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL 于试管中，然后用蒸馏水分别稀释到2.0mL 后再精密加入6%苯酚1.0mL 与浓硫酸5mL，振摇混匀后放置5min，沸水浴加热15min 后立即冷水浴至室温。在490nm 波长处用蒸馏水作为空白对照测定吸收度并绘制标准曲线，回归方程为A (吸收度)=1.1492C (浓度)－0.0004，r=0.9983。

2.3.3 样品溶液中半枝莲粗多糖中总糖含量的测定取1mL 半枝莲样品溶液，经过与2.2.2 相同操作，带入标准曲线，测取多糖含量。

3 试验结果与统计优化

3.1 正交试验结果与分析

根据表1 进行正交试验，获得正交试验结果与方差分析数据如表2 和表3 所示。

表2 正交试验

表3 方差分析

3.2 结论

(1)各因素对指标的影响由极差R 反映，由RA＞RC＞RB知，影响半枝莲粗多糖得率从主到次的因素排序为A (时间)、C (料液比)、B (温度)。

(3)在水平α=0.05 下，F0.05(2，2)=19，由于FA、FB、FC均大于F0.05(2，2=19)，故A、B、C 三因素对半枝莲粗多糖中总糖的提取率影响均显著。

3.3 讨论

通过以上正交试验结果得出，通过传统方法以水提取有效成分，以醇除杂精制的方法提取半枝莲粗多糖中总多糖含量最适高效提取方案为料液比1∶3，100℃下浸提1h。

由于中药特有的复杂性，对于半枝莲的最佳提取工艺［13］仍在摸索之中，尚不具有统一意见。影响半枝莲粗多糖含量的因素有很多，从植物生长环境因素方面来看，不同产地、不同的栽培方式造成的植物的生长环境、温度、湿度等差异都可能引起半枝莲粗多糖含量的高低不等。鉴于半枝莲的产地繁多，李洁［14］对产自云南墨江、江苏南通等地的半枝莲进行了含量测定，测量结果表明，上述产地中半枝莲粗多糖含量最高的为云南墨江为8.12%，而浙江庆元仅含半枝莲粗多糖2.34%，两者相差约3 倍，可见不同产地对半枝莲粗多糖的含量影响较大。从药材加工工艺、药材提取工艺等方面来讲，我们所使用的最为传统的化学成分提取方法是溶剂提取法，其提取时间、温度、次数和料液比均可对其多糖含量造成影响，而随着中药现代化的发展，越来越多的新技术，如微波技术、超临界二氧化碳萃取法、大孔吸附树脂技术也相继用于半枝莲化学成分的提取［15］，力求将药物成分得到最高的利用价值。

本文希望通过对半枝莲粗多糖的提取条件加以试验分析，探索最佳提取工艺，为开发和提高半枝莲资源的利用，以及半枝莲大规模的工业化生产提供更有利的参考价值，为今后的深入研究做好前期铺垫。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典2010年版(一部).北京:中国医药科技出版社，2010:109-110.

［2］郑永红，韦晓瑜，龙继红.半枝莲的研究进展［J］.中草药，2010，41(8):1406-1408.

［3］张福维，回瑞华，侯冬岩.半枝莲挥发性化学成分分析［J］.质谱学报，2009，30(3):175 -178.

［4］叶华，等.半枝莲多糖对C26 荷瘤小鼠血清Th1/Th2 亚群细胞因子的影响［J］.癌症进展，2013，11(1):68-70，81.

［5］李洁，刘盼盼.半枝莲逆转白血病细胞株K562/A02 耐药性的试验研究［J］.中医药导报，2012，18(5):88-89.

［6］宋高臣，等.半枝莲多糖协同环磷酰胺治疗肝癌的作用机制研究［J］.中医药学报，2010，38(4):48-50.

［7］陈爱东，等.半枝莲多糖对小鼠胃癌模型中P21 和VEGF表达的影响［J］.检验与诊断，2013，6:296-297.

［8］于水澜，等.半枝莲多糖对肝癌小鼠差异表达蛋白质影响的试验研究［J］.中医药信息，2014，31(2):15-18.

［9］张晶，赵伟杰.半枝莲多糖对S180 荷瘤小鼠红细胞功能的影响［J］.中国试验方剂学杂志，2013，19(22):265-268.

［10］赵杰，官守涛，等.半枝莲多糖清除氧自由基及抗脂质过氧化作用［J］.中成药，2012，34(7):1361-1364.

［11］张自丽，等.半枝莲多糖对S180 肉瘤转移抑制作用的研究［J］.牡丹江医学院校报，2013，34(2):25-27.

［12］于英君，周群，等.半枝莲多糖辅助化疗药物对小鼠血清TNF-αVEGF 表达的影响［J］.中医药信息，2010，27(1):29-31.

［13］张自丽，宋高臣.半枝莲多糖的提纯及抑瘤作用的研究进展［J］.牡丹江医学院校报，2011，32(6):44-45.

［14］李洁.不同产地半枝莲中多糖含量的比较研究［J］.中药研究与开发，2006，13(10):49-50.

［15］杨连梅，等.半枝莲化学成分的提取和含量测定方法研究［J］.江苏中医药，2010，42(2):78-80.