野生滇橄榄多酚提取工艺的优化

李永强，杨士花，岳晓川，景宏涛，李 淳，初雅洁

(1 云南农业大学食品科学技术学院，昆明 650201;2 云南农业大学外语学院，昆明 650201)

滇橄榄(Phyllanthus emblica)是一种生长在中国亚热带和热带部分地区的常绿乔木。我国滇橄榄资源十分丰富，主产区分布在南方诸省(区)，如云南、四川、贵州、广西、广东、福建、海南、台湾，其中尤以云南、福建两省的产量居多［1］。作为一种重要的药食同源植物资源，滇橄榄除含有大量的氨基酸和微量元素外，在维生素C、黄酮和多酚类物质的含量方面也相当丰富［2］。植物多酚主要包括简单酚、酚酸类、黄酮类、木脂素类、香豆素类、鞣质类以及芪类等化合物［3-5］，在抗衰老、抗氧化、清除自由基、抗癌、抗菌、抗病毒、预防心脑血管疾病等方面效果明显［6-10］，具有很好的开发应用前景。多酚类物质是滇橄榄中最重要的功效成分，但是目前关于滇橄榄多酚提取方面的研究尚未见报道。因此，本研究以野生滇橄榄为原料，以多酚提取率为指标，结合单因素试验和二次通用旋转试验设计，对野生滇橄榄中多酚的最佳提取条件进行了优化，为提高滇野生橄榄的综合利用率以及滇橄榄多酚的开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

滇橄榄(采自云南省盈江县);没食子酸对照品，中国生物制品药品检定所;福林酚试剂，Sigma 公司进口分装;甲醇、乙醇、碳酸钠等均为国产分析纯。

1.2 试验仪器

UV-1600 型紫外可见分光光度计(日本岛津仪器有限公司)、BS-210S 电子天平(北京赛多科斯天平有限公司)、恒温水浴锅(嘉兴市中新医疗仪器有限公司)。

1.3 试验方法

1.3.1 滇橄榄原料的制备 选取无霉烂的滇橄榄并清洗去核，利用组织粉碎机粉碎30s，置于冰箱中保藏。

1.3.2 标准曲线的绘制［11，12］以没食子酸作为标准，以不加没食子酸的样品为空白，用紫外分光光度计于765nm 处测定其吸光度。以没食子酸浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

1.3.3 多酚提取得率的测定 准确量取1mL 多酚提取液加入25mL 比色管中，进行如下操作:加入5mL 0.2 mol/L 福林酚试剂，摇匀，5min 后加入7.5% Na2CO3溶液2 mL，用蒸馏水定容至25mL，室温下暗处放置1h，于765nm 下测定其吸光度(用多酚空白溶液进行调零)。根据所测吸光值，根据多酚标准曲线，求得提取液中多酚含量，计算提取得率如(1)式。

(1)式中:C —提取液中多酚含量(mg/mL)、V —定容体积(mL)、Vt—提取液体积(mL)

1.3.4 滇橄榄多酚的提取 本试验采用乙醇作为提取溶剂［13］，考察提取温度、提取时间、液料比和提取次数对多酚得率的影响。

1.3.5 二次通用旋转试验设计 在单因素试验基础上，利用DPS 软件，进行三因素五水平二次通用旋转试验设计，对滇橄榄多酚的提取工艺进行优化。

2 结果与分析

2.1 多酚标准曲线

以吸光度值A 对没食子酸含量C 作标准曲线，见图1。芦丁浓度在0—0.3mg/mL 范围内与吸光度的线性关系良好。

图1 多酚标准曲线

2.2 单因素试验

2.2.1 提取温度对滇橄榄多酚提取率的影响

精确称取1g 滇橄榄，分别加入50%乙醇20 mL，分别在 20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃下提取2h，提取次数为2 次，过滤后定容至50mL容量瓶中，于765nm 比色测定。

由图2 可知，随着提取温度的升高，多酚的提取得率呈上升趋势，但是当温度大于40℃时，多酚的提取得率随着温度的升高而下降，这是因为提高温度，分子热运动加快，有利于多酚的浸出，但是由于多酚中含有大量的酚羟基，性质非常活泼，温度过高时不稳定，往往发生一些不可逆的化学反应;另一个原因可能是随着温度的升高乙醇的挥发加剧，而使乙醇的浓度下降，降低了提取得率。所以提取温度以40℃左右为宜。

图2 提取温度对多酚提取率的影响

2.2.2 提取时间对滇橄榄多酚提取率的影响

精确称取1g 滇橄榄，加入50% 乙醇20 mL，于40℃下分别提取0.5、1、1.5、2、2.5、3h，提取次数为2 次，过滤后定容至50mL 容量瓶中，于765nm 比色测定。由图3 可知，随着提取时间的延长，多酚提取得率呈上升趋势，但是当提取时间大于1h 后，提取得率随着时间的延长而下降，原因可能是多酚长时间在高温下很容易发生降解、缩合、氧化等化学反应，从而使测定值下降，所以提取时间以1h 为宜。

图3 提取时间对多酚提取率的影响

2.2.3 液料比对滇橄榄多酚提取率的影响

精确称取1g 滇橄榄，按照5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1 液料比以50%乙醇于40℃下提取2h，提取次数2次，过滤后定容至50mL 容量瓶中，于765nm 比色测定。由图4 可知，当液料比低于15∶1 时，提高料液比有助于提高多酚得率;当液料比高于15∶1 时，提高料液比，多酚得率反而出现了下降的趋势。这可能是由于液料比在15∶1 时溶剂已经能将滇橄榄中的多酚溶解出来，液料比选用15∶1 比较合适。

图4 液料比值对多酚提取率的影响

2.2.4 提取次数对滇橄榄多酚提取率的影响

精确称取1g 滇橄榄，加入50%乙醇15mL，40℃下提取2h，分别提取1 次、2 次、3 次、4 次，过滤后定容至50mL 容量瓶中，于765nm 比色测定。由图5 可知，随着提取次数的增加，多酚提取得率逐渐升高;当提取3 次以后，多酚提取得率基本保持不变，同时考虑成本与时间效益，提取次数选择3 次为宜。

图5 提取次数对多酚提取率的影响

2.3 二次通用旋转试验设计

根据单因素试验结果，选择提取温度、液料比和提取时间进行三因素五水平2 次通用旋转试验设计(表1)，优化滇橄榄多酚提取工艺。

表1 因素水平编码

2.4 数学模型的建立与检验［14］

利用DPS 软件对表2 试验结果进行分析，得到二次回归模型为:

表2 二次通用旋转试验方案及结果

由表3 可知，回归方程失拟检验F1=2.132＜F0.05(5，5)=5.05，差异不显著，说明未控制因素对试验结果影响很小，可进一步对回归模型进行拟合检验;拟合检验F2=34.637 ＞F0.01(9，10)=4.94，达到极显著水平，说明方程与实际情况拟合良好，能够反映多酚提取率与提取温度、提取时间、液料比之间的关系。

表3 试验结果方差分析

2.5 数学模型的应用分析［15，16］

2.5.1 主因子效应分析 从建立的回归方程偏回归系数绝对值的大小可判断因子的重要程度，系数的正负表示因子效应作用的方向［14-16］。因此，各因素在试验取值范围内对多酚提取率作用大小依次为X3(提取时间)＞X2(液料比) ＞X1(提取温度)，且全为正效应。

2.5.2 单因子效应分析 将3 个因素中的2 个固定在零水平，对数学模型进行降维分析，得到以其中1 个因素为决定变量的偏回归模型:

(1)、(2)、(3)式等3 个方程，其二次项系数都是负值，说明其表征的效应曲线均是一条开口向下的抛物线，即随着提取温度、液料比和提取时间的不断增加，多酚提取率将表现出先增后减的趋势，说明这3 个因素均存在最佳值，太高或太低都影响多酚提取率。

2.6 试验因子间交互效应分析

对数学模型的方差检验表明，交互项偏回归系数X1X3和X2X3达到了显著水平，即提取温度和提取时间、液料比和提取时间之间的交互作用对多酚提取率影响较大。

2.7 数学模型寻优［14］

2.7.1 变量轮换直接寻优 根据已建立的数学模型，在－1.682 ≤Xi≤1.682 (i=1，2，3)范围内，每个因素取5 个水平(±1.682，±1，0)，对53=125 个方案进行统计寻优，在试验范围内可得多酚提取率最高值为13.33%，此时各因素取值为:X1=1.682、X2=1.682、X3=－ 1.682，对应着提取温度为74℃、液料比为23.4∶1、提取时间为9.5min。

2.7.2 频率分析及统计寻优 变量轮换直接寻优法可求出优化配方组合，但没有考虑到随机因素，在实际生产中是困难的。为此，采用计算机对不同设计水平下的组合进行模拟试验，以零水平的均值11.23 为临界值，获得大于临界值的方案72 个。由表4 可以看出，在95%的置信区间多酚提取率大于11.23%的优化方案为:提取温度为41.9—52.82℃、液料比为5.88∶1—18.55∶1、提取时间为67.36—77.62min。为了贴近实际的工业化生产，可将优化方案定为:提取温度为45℃、液料比为15∶1、提取时间为70min。对此方案进行试验验证得到多酚提取率为11.19%，与优化方案的理论值11.23%比较接近，进一步证实了方案的可靠性。

表4 优化提取方案中Xi取值频率分布

3 结论

(1)采用二次通用旋转试验设计方法，建立影响滇橄榄多酚提取率 (Y)的提取温度 (X1)、液料比(X2)、提取时间(X3)的条件优化数学模型为(4)式

(2)在试验所选的水平范围内，3 个因素对多酚提取率作用大小依次为:X3(提取时间) ＞X2(液料比)＞X1(提取温度)，且全为正效应。

(3)变量轮换直接寻优法求得各因素的优化组合为:提取温度74℃、液料比为23.4 ∶1、提取时间为9.5min。

(4)频率分析及统计寻优求得在95%的置信区间多酚提取率大于11.23% 的优化方案为:提取温度41.9—52.82℃、液料比15.88∶1—18.55∶1、提取时间为67.36—77.62min。为了贴近工业化生产实际，可将优化方案定为:提取温度为45℃、液料比为15∶1、提取时间为70min。

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