双波长HPLC法测定酸性龙胆合剂中龙胆苦苷和橙皮苷的含量Δ

王文月，刘志宏，黄爱文，宋洪涛#（.南京军区福州总医院药学科，福州 350025；2.福建医科大学药学院，福州 35008）

酸性龙胆合剂临床主要用于治疗食欲不振及胃酸缺乏等症。本品处方收载于《中国人民解放军医疗机构制剂规范》（2002年版）中，在该标准的含量测定项中，仅有盐酸的含量测定项，使得其制剂质量难以控制。有研究分别对龙胆苦苷或橙皮苷进行了单独测定[1-4]，但单一指标成分测定难以反映中药质量的整体特征。因此，本研究建立了双波长高效液相色谱（HPLC）法同时测定龙胆苦苷、橙皮苷两种成分含量的方法，以为进一步控制该制剂的质量水平提供参考。

1 材料

1.1 仪器

1100型HPLC仪（美国Agilent公司）；SZ-97A型自动三重纯水蒸馏器（上海亚荣生化仪器厂）。

1.2 药品与试剂

酸性龙胆合剂（自制，批号：20131030、20131106、20131113、20131120、20131127、20131204）；稀盐酸（郑州天耀科技有限公司，批号：130419，分析纯）；橙皮酊（福州海王金象中药制药有限公司，批号：121205）；龙胆苦苷和橙皮苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号分别为：110770-201013、110721-201115，纯度分别为：96.9%、95.3%）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇（A）-0.2%磷酸水溶液（B），梯度洗脱（0～10 min，25%→30%A；10～20 min，30%→40%A；20～23 min，40%A）；流速：1.0 ml/min；检测波长：270 nm（龙胆苦苷）、283 nm（橙皮苷）；柱温：30 ℃；进样量：10 μl。在此色谱条件下，龙胆苦苷和橙皮苷的色谱峰形良好，保留时间分别为6.757、19.910 min，两种组分的理论板数分别以龙胆苦苷峰和橙皮苷峰计均＞3 000，分离度均＞2.0。色谱见图1。

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液 精密量取龙胆苦苷和橙皮苷对照品各适量，加甲醇制成每1 ml分别含龙胆苦苷和橙皮苷400、80 μg的混合对照品溶液，即得。

2.2.2 供试品溶液 精密量取本品2.5 ml，置于10 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

图1 高效液相色谱图A.混合对照品；B.供试品（270 nm）；C.不含龙胆的阴性对照（270 nm）；D.供试品（283 nm）；E.不含陈皮阴性对照（283 nm）；1.龙胆苦苷；2.橙皮苷Fig 1 HPLC chromatogramsA.mixed substance control；B.test sample（270 nm）；C.negative control withoutR.Gentianae（270 nm）；D.test sample（283 nm）；E.negative control withoutC.reliculate（283 nm）；1.gentiopicroside；2.hesperidin

2.2.3 阴性对照溶液 按处方分别取各味药材适量，按处方工艺分别制备不含龙胆和陈皮的阴性样品，再按“2.2.2”项下供试品溶液的制备方法分别制备阴性对照溶液，即得。

2.3 线性关系考察

精密量取混合对照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 ml，置于10 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，混匀，经0.45微孔滤膜滤过，分别按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以峰面积（A）为纵坐标、对照品的质量浓度（c，µg/ml）为横坐标，绘制标准曲线，得龙胆苦苷的回归方程为A＝10.037 3c－65.697 6（r＝0.999 7）、橙皮苷的回归方程为A＝9.132 7c－5.688 5（r＝0.999 7）。结果表明，龙胆苦苷和橙皮苷的质量浓度分别在20～200、4～40µg/ml范围内与峰面积呈良好线性关系。

2.4 精密度试验

精密量取混合对照品溶液适量，按“2.1”项下色谱条件重复进样测定6次，记录峰面积。结果，龙胆苦苷和橙皮苷的峰面积RSD分别为0.54%、1.16%（n＝6），表明仪器精密度良好。

2.5 重复性试验

精密称取同一批号的样品（批号：20131204）各适量，共6份，按“2.2.2”项下方法制备供试溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定6次，记录峰面积。结果，龙胆苦苷、橙皮苷的峰面积RSD分别为1.39%、1.32%（n＝6），表明该方法重复性良好。

2.6 稳定性试验

精密称取同一批样品制备的供试品溶液适量，分别于放置0、1、4、8、12、24 h时按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，龙胆苦苷、橙皮苷的峰面积RSD分别为1.89%、1.46%（n＝6），表明供试品溶液在室温下24 h内稳定性良好。

2.7 加样回收率试验

取已知含量的样品适量，共9份，分别精密加入一定量的龙胆苦苷和橙皮苷对照品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，混匀，经0.45 μm微孔滤膜滤过。按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算加样回收率，结果见表1。

表1 加样回收率试验结果（n＝9）Tab 1 Results of recovery test（n＝9）

2.8 样品含量测定

精密称取6批酸性龙胆合剂样品各适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算各指标成分的质量浓度，结果见表2。

表2 样品含量测定结果（n＝6，mg/ml）Tab 2 Results of content determination of samples（n＝6，mg/ml）

3 讨论

3.1 测定指标的选择

酸性龙胆合剂是由龙胆、陈皮和豆蔻3味中药材加工制成的制剂。龙胆的主要成分包括裂环环烯醚萜及其苷类、生物碱、三萜类、黄酮类等化合物。其中，裂环环烯醚萜为龙胆的主要活性部位，包括龙胆苦苷、獐牙菜苦苷和当药苷等，龙胆苦苷为其指标性成分，故选其为含量测定指标[5]。陈皮主要含挥发油及橙皮苷为主的黄酮类成分等，故选择橙皮苷为其含量测定指标[6]。豆蔻又称白豆蔻，其中含有的大量挥发油是其重要的药效成分，由于挥发油的含量测定采用的是气相色谱法，故本研究未将其进行同时测定。

3.2 流动相的选择

龙胆苦苷的含量测定方法收载于2010年版《中国药典》（一部）中，以十八烷基硅烷键合胶柱为填充剂，以甲醇-水（25∶75，V/V）为流动相，检测波长为270 nm[7]。《中国药典》中橙皮苷的含量测定方法中流动相为甲醇-醋酸-水（35∶4∶61，V/V/V），检测波长为283 nm[7]。因龙胆苦苷和橙皮苷的流动相皆为甲醇-水，并参考相关文献[1-4]，试验时以甲醇-水为流动相系统，并加入醋酸和磷酸作改性剂时，各峰峰形较好，分离度较高。

3.3 含量限度的确定

本研究结果表明，合剂中龙胆苦苷的质量浓度为0.330～0.339 mg/ml，橙皮苷质量浓度为0.069～0.076 mg/ml。2010年版《中国药典》（一部）中龙胆药材规定龙胆苦苷的质量分数不得低于3.0%，陈皮药材规定橙皮苷的质量分数不得低于3.5%。按处方量折算，酸性龙胆合剂中龙胆苦苷质量浓度理论值为0.6 mg/ml，橙皮苷质量浓度理论值为0.63 mg/ml。考虑到药材不同及渗滤工艺的提取率较低，根据6批样品的质量浓度测定结果，取平均值的一半，规定合剂龙胆苦苷质量浓度每1 ml不得少于0.017 mg，橙皮苷质量浓度每1 ml不得少于0.036 mg。

综上所述，本研究可为拟订《中国人民解放军医疗机构制剂规范》中酸性龙胆合剂的含量测定提供可靠依据。

[1]杨慧玲，司庆文，侯勤正，等.HPLC法测定不同海拔长柄秦艽中龙胆苦苷、马钱酸、獐牙菜苦苷和獐牙菜苷[J].中草药，2010，41（10）：1 720.

[2]许秋霞，李小芳，舒予，等.干燥方法对龙胆炮制品中龙胆苦苷含量的影响[J].中国药房，2013，24（7）：622.

[3]汪金玉，帅欧，林励，等.橘叶黄酮类成分的研究与薄层色谱鉴别[J].广州中医药大学学报，2011，28（2）：191.

[4]马秋菊，孙萍.消脂通脉颗粒的质量标准研究[J].中国药房，2013，24（35）：3 325.

[5]杨维霞.秦岭龙胆的化学成分研究[D].杨凌：西北农林科技大学，2004.

[6]王元清，严建业，师白梅，等.不同批次枳壳中柚皮苷、新橙皮苷、总黄酮、挥发油的含量比较及质量评价[J].中国实验方剂学杂志，2012，18（7）：146.

[7]国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].2010版.北京：中国医药科技出版社，2010：89-176.