小鼠急性心肌梗死后IL-1β和IL-6的动态变化及3甲基腺嘌呤的影响

陈法江 何丽姗 李康兰 杨 娅 罗健东

( 广州医科大学药理教研室， 广东 广州 510182)



·论著·

小鼠急性心肌梗死后IL-1β和IL-6的动态变化及3甲基腺嘌呤的影响

陈法江 何丽姗 李康兰 杨 娅 罗健东*

( 广州医科大学药理教研室， 广东 广州 510182)

目的:探讨小鼠急性心肌梗死(AMI)后炎症因子IL-1β和IL-6的动态变化及3-甲基腺嘌呤对心肌炎症因子IL-1β和IL-6释放的影响。方法：雄性C57BL/6小鼠随机分成四组：假手术组、AMI 1 d组、AMI 7 d组、AMI 21 d组，用超声心动仪检测心功能变化，用荧光定量PCR法、ELISA法和免疫组化法测量血清和心肌组织中炎症因子IL-1β和IL-6的变化，用免疫蛋白印迹方法检测心肌组织IL-1β转换酶caspase-1蛋白的变化情况。在AMI 后给予3-甲基腺嘌呤7 d，用超声心动仪检测心功能变，用ELISA法和免疫组化法测量心肌组织中炎症因子IL-1β和IL-6的变化情况。结果：小鼠冠状动脉左前降支结扎术后7、21 d心功能显著下降。小鼠AMI 后炎症因子IL-1β和IL-6的mRNA水平表达增加，在血清和心肌组织中蛋白含量增加(P<0.05)。小鼠AMI 后心肌中caspase-1蛋白表达增加(P<0.05)。3-甲基腺嘌呤加重小鼠AMI 7 d后心脏功能下降(P<0.05)，并促进炎症因子IL-1β和IL-6的释放(P<0.05)。结论：小鼠心肌损伤过程中炎症因子IL-1β和IL-6表达增加，其机制可能跟AMI 后caspase-1的增加有关；3-甲基腺嘌呤加重AMI 后心功能的下降，其机制可能与促进炎症因子释放有关。

急性心肌梗死；3-甲基腺嘌呤；炎症因子；白介素-1；白介素-6；半胱氨酸天冬氨酸酶-1

冠心病已成为人类死亡的首要原因，急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是冠心病中的急危重症。目前临床广泛的救治手段是在治疗窗内对闭塞的冠状动脉进行血运重建，如经皮冠状动脉介入治疗和冠状动脉搭桥术，但是缺血造成心肌细胞炎症等损伤导致心脏功能下降仍然是AMI临床治疗的重要障碍[1]。各种诱因导致的血栓形成阻断冠脉血流引发AMI后异常激活炎症反应系统，致IL-1β、IL-6等促炎因子分泌增多，共同参与心肌细胞肥大、心肌纤维化等病理过程，成为导致心肌进行性重构、心功能恶化的重要原因[2]。半胱氨酸天冬氨酸酶 (caspase)-1是caspase超家族的重要成员，能够将IL-1β前体切割为具有活性的IL-1β，活性的IL-1β可激活下游NF-κB信号通路，促进IL-6等炎症因子的释放[3]，被认为与机体的炎症反应和细胞凋亡有关。鉴于炎症因子在AMI病程中扮演重要角色，本研究旨在观察小鼠AMI后促炎因子的动态变化以及可能的相关机制，为临床进一步认识AMI的病理生理过程提供依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物

雄性清洁级C57BL/6小鼠68只，体质量 24～26 g，由广东省动物实验中心提供，许可证：SCXK 粤 2008-0002。

1.2 主要试剂

3-甲基腺嘌呤购自美国Sigma公司。BCA蛋白定量试剂盒购自美国Pierce。蛋白电泳分子量(10～170kDa) 标记购自加拿大Fermentas。IL-1β抗体、IL-6抗体、caspase-1 抗体、GAPDH抗体、抗兔Ⅱ抗购自美国Santa Cruz。ELISA试剂盒购自深圳欣博盛。逆转录试剂盒购自日本Takara。SYBR®Green Ⅰ荧光定量试剂购自Roche。引物合成购自美国Invitrogen。其余试剂均为分析纯产品。所用引物由美国Invitrogen公司根据设计合成，见表1。

表1 荧光定量PCR所用的引物

1.3 研究方法

1.3.1 分组 将小鼠随机分成5组：假手术组(AMI 0d，n=10)：小鼠冠状动脉左前降支(LAD)只穿线不结扎；AMI 1d组(n=16)：小鼠LAD进行结扎；AMI 7d组(n=16)：小鼠LAD进行结扎；AMI 21d组(n=16)：小鼠LAD进行结扎；AMI 7d+3-甲基腺嘌呤组(AMI 7d+3MA组，n=9)：小鼠LAD进行结扎后，给予3-甲基腺嘌呤[15 mg/(kg·d)]。

1.3.2 小鼠AMI模型的建立[4]连接心电图，气管插管，连接小动物呼吸机，正压通气，频率为 150次/min，呼吸气时比为5∶4，潮气量约 1.5 mL/kg。于左胸第3～4肋间开胸，暴露心脏。在左心耳与肺动脉圆锥间，以左冠状动脉主干为标志，用8～0号缝线针穿刺结扎LAD。观察心电图，以心电图Ⅱ导联出现 ST 段抬高及肉眼观察结扎区域以下组织变白等心肌缺血表现确定为结扎成功的指标；结扎确实后，膨肺，逐层关胸。

1.3.3 超声测量心功能 实验结束进行M型超声心动图检测。采用加拿大Visual Sonics产的Vevo2100高分辨小动物超声成像系统(RMV707B 探头，频率设置为23MHz或30 MHz，探测深度为10～15 mm)和连接高频探头西门子超声仪。2%异氟烷吸入麻醉，仰卧位固定，左胸前化学脱毛膏脱毛，在胸廓表面涂抹超声波导声剂，探头置于小鼠胸骨前，获取胸骨旁长轴、短轴视野。左室短轴切面，于乳头肌水平应用M型超声记录左心室运动曲线，测量左室舒张末期和收缩末期内径 (left ventricular internal dimension，diastolic；left ventricular internal dimension,systolic； LVIDd和LVIDs)，左室射血分数(left ventricular ejection fraction, LVEF)、左室短轴缩短率(fractional shortening, FS)。

1.3.4 荧光定量PCR法检测IL-1β、IL-6 mRNA的表达 根据Takara逆转录试剂盒合成cDNA，样本按以下反应体系进行：总体积25 μL，其中SYBR®GreenⅠ12.5 μL，上游引物 F 0.5 μL，下游引物R 0.5 μL，ddH2O 10.5 μL，母版DNA1 μL。反应条件为，95 ℃ 10min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40个循环。

1.3.5 细胞因子的测定方法 用酶联免疫方法测定心肌组织和血清IL-1β、IL-6水平。步骤如下：①除空白孔外，分别将标本或不同浓度标准品(100 μL/孔) 加入相应孔中，用封板胶封住反应孔，36℃孵箱孵育90 min，洗板； ② 除空白孔外，加入生物素抗体工作液(100 μL /孔) 封住板孔，36℃孵箱孵育60 min，洗板； ③加入酶结合物工作液(100 μL /孔) 封住板孔，36℃孵箱孵育30 min，洗板；④加入显色剂(100 μL /孔)，36℃避光显色15 min；⑤加入终止液(100 μL /孔)，混匀即刻测量A450 值； ⑥在手工绘制的标准曲线上测出标本的浓度。

1.3.6 免疫组织化学 用免疫组织化学方法测定心肌IL-1β、IL-6水平。标本常规固定、 石蜡包埋后切片，免疫组织化学染色，光学显微镜下观察心肌IL-1β、IL-6的表达。

1.4 统计学分析

2 结 果

2.1 小鼠AMI7、21d后心脏功能下降

本实验共准备68只雄性C57BL/6小鼠进行AMI手术。根据小鼠LAD结扎前后心脏结扎区域心肌颜色的变化情况和心电图Ⅱ导联ST段是否抬高来判断手术是否成功。总体造模成功57只小鼠,成功率为83.82%。小鼠行LAD结扎1、7和21d后分别进行超声心功能检测,结果显示AMI7、21d后小鼠心功能下降(P<0.05)，见图1。

2.2 小鼠AMI1、7和21d后心肌IL-1β和IL-6mRNA表达增加

实验结束后迅速取AMI周边区于提取RNA进行荧光定量PCR实验，结果显示AMI1、7和21d后小鼠心脏组织IL-1βmRNA表达增加，而IL-6mRNA表达在AMI1d达到峰值，随后下降，但与正常组相比仍具有统计学差异(P<0.05)，见图2。

注：A：M-模式图典型代表团；B：左心室收缩末内径、左心室舒张末内径、射血分数和短轴缩短率的统计分析；与假手术组比较，*P<0.05

图1 小鼠AMI后心脏功能变化情况

注：与假手术组比较，*P<0.05

图2 小鼠AMI后心肌IL-1β和IL-6的mRNA水平

2.3 小鼠AMI 1、7 d后心肌和血清中IL-1β和IL-6表达增加

实验结束后麻醉小鼠行主动脉取血并迅速取AMI周边区进行ELISA法实验，结果显示AMI 1、7d后小鼠心脏组织和血清中IL-1β和IL-6表达增加(P<0.05)，见图3。

2.4 小鼠AMI 1、7和21 d后心肌IL-1β和IL-6 免疫组化结果

实验结束后迅速取心脏固定于4%多聚甲醛，石蜡包埋切片后进行免疫组化法检测，结果显示AMI 1、7、21 d后小鼠心脏组织IL-1β和IL-6表达增加。见图4

注：与假手术组比较，*P<0.05

图3 小鼠AMI后心肌和血清IL-1β和IL-6的含量

图4 小鼠AMI后心肌IL-1β和IL-6的表达变化情况(×400)

2.5 小鼠AMI 1、7和21 d后心肌caspase-1蛋白表达增加

实验结束后迅速取AMI周边区提取蛋白进行蛋白印迹法实验，结果显示AMI 1、7 d后小鼠心脏组织活化的caspase-1蛋白表达增加(P<0.05)，见图5。2.6 小鼠AMI后给予3-甲基腺嘌呤后心功能下降，心肌细胞IL-1β和IL-6的表达增加

C57BL/6小鼠进行AMI手术后即腹腔注射3-甲基腺嘌呤[15 mg/(kg·d)]，给药7 d后进行进行超声心功能检测, 结果显示，与AMI 7d组相比，给予3-甲基腺嘌呤7 d后小鼠心功能下降，LVIDs增加，EF、FS下降(P<0.05)，心肌细胞IL-1β和IL-6的表达增加(P<0.05)，见图6，7。

注：与假手术组比较，*P<0.05

图5 小鼠AMI后心肌活化的caspase-1蛋白的表达情况

注：与假手术组比较，*P<0.05

图6 小鼠AMI并注射3-甲基腺嘌呤7 d后心脏功能变化情况

注：与AMI 7 d组比较，*P<0.05

图7 3-甲基腺嘌呤促进小鼠AMI 7 d后心肌IL-1β和IL-6的表达

3 讨 论

心肌缺血是威胁人类健康的常见心血管疾病。明确AMI的发病机制对于临床治疗具有重要的现实意义[5-6]。AMI的基本病因是冠状动脉粥样硬化斑块的破裂、出血和血栓的形成，造成管腔严重狭窄或闭塞引起心肌血供不足或中断[7-8]。本研究发现随着小鼠LAD结扎时间的增长，心脏功能逐渐下降。AMI后心输出量的急剧减少引起机体和各组织器官血供减少，导致内环境失衡，产生大量自由基激活单核巨噬细胞系统，使 IL -1β、IL -6等炎症因子水平升高，并引起反应逐级放大，引起炎症反应综合征、加重心肌组织缺氧、功能障碍[9]。

Yuan等[10]在1993年发现IL-1β转换酶(IL -1β converting enzyme, ICE)与秀丽线虫(Caenorhabditis elegans)的死亡基因CED-3具有高度同源性，过表达该基因可以诱导细胞凋亡的发生，于是ICE后来被重新命名为caspase-1，故caspase-1也可以被称为IL -1β转换酶。caspase-1是以无活性的酶原形式(pro-caspase-1)存在于细胞质中，其分子量为45 kDa，其活化需要炎性平台[11]。当机体受到各种病原体或其他刺激时细胞内会生成炎性体，该炎性体可以募集pro-caspase-1并形成相对局部高浓度，此时酶原自体水解，形成具有活性的caspase-1，后者通过促进炎症因子IL-1β的加工和释放而调控细胞的炎症反应[3]。IL-1β是细胞内重要的促炎症因子，与相应受体结合而激活下游的NF-κB信号通路，促进如IL-3、IL-5、IL-6等炎症因子的释放。

本研究发现在小鼠AMI急性期(AMI 1d)和亚急性期(AMI 7d)心肌炎症因子IL -1β、IL -6的mRNA和蛋白表达水平增加，释放入血清中的炎症因子IL -1β、IL -6也增加，但是在修复期(AMI 21d) 时IL -1β、IL -6的表达又明显下降了，表明炎症因子IL -1β、IL -6参与了AMI急性期和亚急性期的病理生理进展过程，而在修复期时炎症对心肌重构的作用就减弱了。同时发现在小鼠AMI急性期和亚急性期心肌caspase-1前体表达下降，而有活性的caspase-1表达增加，而在修复期时活化的caspase-1表达减少。本研究发现小鼠AMI后心脏活性caspase-1的表达与炎症因子IL -1β、IL -6的表达具有一定的同步性，那么AMI后炎症因子IL -1β、IL -6的增加与caspase-1信号通路的变化是否具有一定的因果关系，尚需进一步的研究探讨。

本研究发现3-甲基腺嘌呤可以促使AMI后心脏功能的进一步恶化，同时进一步促进炎症因子IL-1β和IL-6的表达，但是其机制尚不清楚。很多文献报道3-甲基腺嘌呤可抑制自噬的水平[12]，有研究3-甲基腺嘌呤可以抑制III型PI3K或干扰Bcl-2和Beclin-1的表达[13]，发现因此3-甲基腺嘌呤加AMI后心功能的恶化，有可能与抑制自噬途径有关，需要进一步进行试验研究探讨。

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[13] 孔晓霞, 张宏宇, 钟加滕, 等. 自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤在H2O2引起的神经胶质瘤U251细胞损伤中的作用[J]. 中国病理生理杂志,2011,27(4):695-698.

(本文编辑:王馨)

·医学新闻·

前列腺癌：非手术方法治疗效果或许更好

据生物谷报道，一项由美国约翰霍普金斯大学Brady泌尿研究所完成的统计学研究表明，对于成年男性中那些非侵略性前列腺癌患者和由泌尿专家监控病情的前列腺癌患者，其发展成为恶性前列腺癌的概率和死于癌症的概率很低。这项研究分析了过去20年间，1298位参与“前列腺癌主动监控”项目的成年男性患者中，仅有两位死于前列腺癌和三位发展为了恶性前列腺癌。

这项研究的领导者、成年泌尿专科主任H. Ballentine Carter教授指出，通过他们的统计学数据，那些只患有非侵略性前列腺癌和长期处于医生监控监控下的前列腺癌患者们的死亡率很低。虽然说，这个“前列腺癌主动监控”项目的患者有的是被“精心选择”过的，但是如果继续这项研究，Carter教授认为结果也不会有太大变化。原因在于，三位死者中的两位的死亡另有其他原因。同时，Carter教授也指出，这项研究是在高加索人种(白人)中完成的，可能并不适用于黑人，因为黑人的癌症往往为恶性癌症。

Effect of 3-methyl adenine on dynamic changes of IL-1β and IL-6 in mice with acute myocardial infarction

ChenFajiang,HeLishan,LiKanglan,YangYa,LuoJiandong

(DepartmentofPharmacology,GuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou510182,China)

Objective:To investigate the dynamic changes of the inflammatory cytokines, interleukin-1β (IL-1β) and IL-6 in mice after acute myocardial infarction (AMI) and the effect of 3-methyl adenine on the release of myocardial inflammatory cytokines IL-1β and IL-6.Methods:Male C57BL/6 mice were randomly divided into four groups:sham operation group, AMI 1 day (AMI 1d) group, AMI 7 days (AMI 7d) group, and AMI 21 days (AMI 21d) group. We determined the changes of heart function by echocardiography, the changes of inflammatory cytokines IL-1β and IL-6 in serum and myocardial tissue by fluorescent quantitative polymerase chain reaction (FQ-PCR), enzyme-linked immuno sorbent assay (ELISA) and immunohistochemistry, and IL-1β converting enzyme caspase-1 protein in myocardial tissue by Western blotting. All mice were given 3-methyl adenine for seven days after AMI. We determined the changes of heart function by echocardiography, the changes of inflammatory cytokines IL-1β and IL-6 in myocardial tissue by ELISA and immunohistochemistry. Results: The heart function in mice was significantly decreased at 7 and 21 d after left anterior descending coronary artery ligation. Increased mRNA expression levels of inflammatory cytokines IL-1β and IL-6, and increased protein levels in serum and myocardial tissue were found in mice after AMI (P<0.05). The caspase-1 protein expression was increased in myocardial tissue in mice after AMI (P<0.05). 3-methyl adenine aggravated heart dysfunction in the AMI 7d group (P<0.05), and promoted the release of inflammatory cytokines IL-1β and IL-6 (P<0.05). Conclusion:In the process of myocardial injury, inflammatory cytokines IL-1β and IL-6 expression are increased in mice. The mechanism may be associated with the increased caspase-1 after AMI. 3-methyl adenine aggravates heart dysfunction in mice after AMI, probably via the release of inflammatory cytokines.

acute myocardial infarction; 3-methyl adenine; inflammatory factor; interleukin-1;interleukin-6; caspase-1

10.3969/j.issn.2095-9664.2015.05.002

国家自然科学基金资助项目(81173062)

陈法江(1989-)，男，硕士，助理研究员。

R363

2095-9664(2015)05-0006-06

2014-07-24)

研究方向：心血管药理学。

*通讯作者:E-mail:jiandongluo@hotmail.com