吗啡依赖戒断大鼠海马区长时程增强变化研究

崔跃 朱启文 商丽宏 崔皓哲 徐畅

吗啡依赖戒断大鼠海马区长时程增强变化研究

崔跃 朱启文 商丽宏 崔皓哲 徐畅

目的应用在体电生理方法观察吗啡依赖戒断后大鼠海马CA1区长时程增强(LTP)的变化情况。方法18只健康SD大鼠, 随机分为吗啡依赖组、戒断组、盐水对照组, 每组6只。建立大鼠吗啡依赖戒断模型, 在制备模型基础上, 采用在体脑立体定位胞外电生理记录技术检测海马CA1区LTP的变化情况。结果与对照组相比, 吗啡依赖组、戒断组大鼠在高频刺激(HFS)后, 各时间点所记录的群体峰电位(PS)相对幅值显著降低, 差异有统计学意义(P＜0.05)。结论吗啡依赖戒断大鼠海马LTP减弱, 提示LTP参与吗啡依赖戒断过程。

吗啡；依赖；戒断；长时程增强

吗啡是中枢镇痛性药物, 而且具有很强的成瘾性, 长期应用吗啡, 可产生强迫性药物使用行为, 因此限制了其临床应用范围。大量文献表明, 吗啡成瘾的发生发展过程和经典的学习记忆过程有众多相似之处, 与学习记忆有关的关键脑区、信号转导分子和转导通路都参与了药物依赖的形成和心理渴求[1,2]。研究认为, 成瘾相关记忆占据了正常学习记忆通路,导致病理性学习记忆对成瘾的记忆[3]。另一方面, 吗啡长期应用会对学习记忆相关能力, 如认知能力等产生损害[4-6],可见吗啡成瘾与学习记忆之间的关系错综复杂。

海马在关联性学习过程中的作用非常重要, 海马区LTP是某些记忆形式的神经生物学基础的电生理指标, 海马区LTP的诱导与保持和学习记忆过程有密切的关系, 被广泛应用于评价影响中枢学习与记忆功能药物的药理学研究[5,7],并已被认为是成瘾研究中的重要技术手段[8]。

本项研究通过建立大鼠吗啡依赖和戒断模型, 应用在体脑立体定位胞外电生理记录技术, 在动物整体水平上观测吗啡依赖戒断大鼠对海马CA1区LTP的影响, 并探讨其可能的机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 健康SD大鼠, 体重200 ～260 g；盐酸吗啡, 青海制药厂；纳洛酮(Sigma, 美国)；氨基甲酸乙酯(乌拉坦),北京化学试剂公司。

1.2 方法

1.2.1 模型制备18只大鼠采用随机数字法进行分组, 共三组：吗啡依赖组、戒断组、盐水对照组, 每组6只。参照文献[9,10]建立慢性大鼠吗啡依赖模型：大鼠腹腔内注射盐酸吗啡, 首次剂量为10 mg/kg,2次/d(8：00,16：00), 接下来的吗啡剂量每日增加10 mg/kg, 一共注射7 d, 其中第6、7天的注射剂量保持在50 mg/kg, 于第7天早8：00注射吗啡50 mg/kg1次, 建成吗啡依赖模型。盐水对照组每次腹腔注射相等量的的生理盐水。参照文献[11,12]建立纳洛酮诱发戒断模型, 于第7天吗啡注射2 h后, 戒断组腹腔注射纳洛酮(4 mg/kg)进行急性催促戒断, 从而建立吗啡戒断模型。

1.2.2 CA1区LTP的测量 电极埋植方法：应用20%乌拉坦(0.75 ml/100 g)腹腔注射麻醉大鼠, 并将其固定在脑立体定位仪上。在颅骨表面相应位置钻两个直径约3 mm左右的孔, 用于埋植电极, 记录电极位置(AP3.4 mm、L或R2.5 mm、H2.4～3.0 mm), 刺激电极位置(AP4.2 mm、L或R3.8 mm、H2.4～3.0 mm)。在立体定位仪上根据图谱, 按照相应的坐标调整两个电极的适宜位置, 当应用固定强度的刺激可以记录到最大群体峰电位(population spike, PS)时将电极固定好。PS记录及幅值计算方法：海马CA1区细胞兴奋性的指标用PS幅值来表示。PS记录采用细胞外记录。测试刺激是单个电脉冲, 波宽为0.2 ms, 每次间隔为15 s, 强度为引起最大群体电位的50%。由电子刺激器产生, 经隔离器和刺激电极输出。高频刺激(high frequency stimulation, HFS)参数：频率100 Hz、波宽0.2 ms, 共4串刺激, 每串含有50个刺激, 每串刺激间隔为10 s, 刺激强度大小为诱导电位最大值的75%所对应的刺激强度。高频刺激后再用上述的单个刺激进行检测, 并观察持续时间, 并且测量PS幅值及峰潜伏期, PS幅值增大超过20%并持续30 min以上可以视为产生了LTP。实验结束后, 对记录部位进行组织学鉴定, 符合要求的资料纳入统计。

1.3 统计学方法 采用SPSS16.0统计学软件对数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差(±s)表示, 采用方差分析进行统计检验。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 吗啡依赖戒断大鼠模型戒断症状评分结果 通过对大鼠纳洛酮诱发戒断症状的实验记录, 观察到吗啡依赖大鼠催促戒断后出现明显的齿颤、湿狗样抖动、跳跃、腹泻、流涎、体质量下降等戒断症状。戒断症状45 min的 Gellert-Holtzman 评分结果为：戒断组(27.39±0.79)分、盐水对照组(2.29±0.91)分。与盐水对照组比较, 差异具有统计学意义(P＜0.01), 表明吗啡依赖大鼠模型制备成功。

2.2 吗啡戒断对海马CA1区长时程增强的影响 在高频刺激后, 盐水对照组大鼠的PS幅值明显增强, 幅值平均增加到刺激前的(153.56±7.83)%, 并且维持4 h无明显减弱。高频刺激后, 戒断组大鼠长时程增强的诱导受到明显抑制, 幅值平均增加到刺激前的(119.87±8.11)%, 与盐水对照组比较差异具有统计学意义(P＜0.05), 见图1。结果表明, 吗啡戒断后抑制高频刺激后的突触传递长时程增强。

图1 吗啡戒断组突触传递长时程增强的变化情况

3 讨论

长期应用吗啡, 可以使机体产生依赖性, 如果突然中断外源性吗啡的应用, 机体会出现内源性阿片样肽的绝对不足,进而出现一系列机体的功能紊乱, 表现为多个系统的严重戒断症状, 如烦躁不安、焦虑、抑郁等[13]。此次实验也观察到,吗啡依赖戒断大鼠出现明显的戒断症状。

众多实验证据表明, 海马脑区突触传递的LTP是学习与记忆的神经生物学基础之一[7,14,15], 海马脑区LTP的改变是其突触可塑性的具体表现之一。海马突触可塑性的改变是参与药物成瘾复吸的中枢机制之一[16]。本研究观察到, 吗啡戒断明显抑制LTP的诱导, 提示戒断组大鼠海马脑区的突触传递效能受到抑制。阿片类物质在体内代谢快, 但是长期应用后, 其与机体的相互作用会引起一系列适应性改变。有研究表明, 慢性吗啡处理后, μ-阿片受体数量减少达50%左右[17], μ-阿片受体下调的改变, 可能是吗啡长期应用后使神经元反应性降低的原因之一。

总之, 本研究中, 观察到μ-阿片受体抑制剂纳洛酮应用后, 可以抑制海马脑区LTP, 此结果表明阿片肽系统在非NMDA受体依赖性LTP的形成中起到重要的作用。药物成瘾与突触可塑性之间的关系异常复杂。药物成瘾是一个相当复杂的神经生物学、医学心理学和社会学问题。其确切机制有待进一步的深入研究。

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Research of long-term potentiation changes in hippocampal region of rats with morphine dependence withdrawal

CUI Yue, ZHU Qi-wen, SHANG Li-hong, et al. Teaching and Research Office of Physiology, School of Basic Medicine of Shenyang Medical College, Shenyang110034, China

ObjectiveTo investigate the changes of long-term potentiation (LTP) in hippocampal CA1 region of rats with morphine dependence withdrawal.MethodsA total of18 healthy SD rats were randomly divided into morphine dependence group, withdrawal group, and saline water control group, and each group contained6 rats. Model of morphine dependence withdrawal rats was established. On the basis of model, changes of LTP in hippocampal CA1 region were detected by brain stereotaxic cell electric physical recording technique.ResultsCompared with the control group, rats in morphine dependence group and withdrawal group had significantly reduced population spike (PS) after high frequency stimulation (HFS). Their difference had statistical significance (P＜0.05).ConclusionReduced LTP in hippocampal region of rats shows that LTP is involved in process of morphine dependence withdrawal.

Morphine; Dependence; Withdrawal; Long-term potentiation

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2015.09.191

2014-12-12]

国家自然科学基金资助(项目编号：81441110)；辽宁省教育厅科学研究一般项目(项目编号：L2014405)；沈阳医学院博士科研启动基金(项目编号：20133049)

110034 沈阳医学院基础医学院生理学教研室(崔跃 朱启文), 实验室(商丽宏)；基础医学院2012级临床医学专业(崔皓哲 徐畅)