白桦BplMYB46转录因子的原核表达和重组蛋白的纯化1)

国会艳 刘志华 胡萍 贾园园 张春蕊 杨传平 王玉成

(牡丹江师范学院，牡丹江，157012) (林木遗传育种国家重点实验室(东北林业大学))

责任编辑:潘 华。

干旱、高盐以及高温和低温等逆境胁迫给植物造成严重的伤害，致使植物生长滞后、品质下降。植物在逆境胁迫下会产生相应的生理应答反应，减轻或避免逆境给植物带来的损害。近年来，有大量的研究表明转录因子在植物的逆境胁迫应答中起着至关重要的作用，能够调控下游功能基因在特定时间或者特定部位的适量表达，从而实现植物对逆境的胁迫应答［1］。因此，对于转录因子的研究显得尤为关键。

MYB 转录因子有着广泛的生理功能，参与细胞的分化，响应激素和环境因子的应答，在植物的次生代谢和叶片等器官的形态建成等方面具有重要的作用［2］。很多研究发现，MYB 转录因子参与植物的逆境胁迫应答，Vanninia 等［3］研究发现水稻的OsMYB4基因在拟南芥中的过表达引起了254 个基因上调表达，从而使植物的抗寒、抗旱以及耐盐能力明显提高。Liao 等［4］在大豆中发现43 个MYB 基因，它们在盐、旱、ABA 以及低温胁迫条件下表达量发生显著的变化，利用酵母单杂交和酵母双杂交等技术深入研究GmMYB76、GmMYB92 和GmMYB177 这3 个基因，结果发现GmMYB 基因能够通过调控下游的抗逆响应基因增强大豆的抗逆能力。一些研究发现MYB 转录因子参与植物的次生壁合成，Zhong 等［5］发现拟南芥的AtMYB46 是次生壁合成相关的NAC结构蛋白直接调控的转录因子，能够促进植物次生细胞壁的形成。Zhong 等［6］研究发现MYB43、MYB52、MYB54、MYB58 和MYB63 是AtMYB46 直接调控的下游转录因子，参与植物次生壁的形成。关于MYB 转录因子参与类黄酮生物合成途径的相关研究也很多，褐梨的PyMYB10 转录因子在调节类黄酮的生物合成中起着重要的作用，PyMYB10 基因的过表达能够诱导花青素的积累［7］;酵母双杂交实验证明烟草的一个MYB 转录因子能够与5 个BHLH 转录因子相互作用来诱导花青素的合成［8］。尽管关于MYB 转录因子的研究很多，但是它们的功能还没有被完全的阐述清楚。

转录因子一般通过与下游基因启动子上的顺式作用元件结合来调控下游基因的表达，从而行使其相 应 的 功 能。Zhong 等［9］研 究 发 现 杨 树 的PtrMYB2/3/20/21 通过与ACC(A/T)A(A/C)(T/C)元件结合促进植物次生细胞壁的形成;AtMYB61结合ACCTAC 元件，能够调节木质部细胞分化、侧根生长和改变气孔的大小［10］。Kim 等［11］研究发现拟南芥的AtMYB46 能够与(A/G)(G/T)T(A/T)GGT(A/G)元件结合，是植物次生细胞壁合成过程中的主要开关基因。由此看来，研究转录因子与顺式作用元件的互作是非常重要的，酵母单杂交和电泳迁移率实验是研究转录因子与元件互作的常用并且有效的方法。Wang 等［12］利用酵母单杂交技术证明柽柳的ThERF1 转录因子能够与GCC- box 和DRE 元件结合，从而增强了柽柳的抗旱和耐盐能力;Zhong 等［6］利用电泳迁移率实验证明AtMYB46和AtMYB83 能够与ACC(A/T)A(A/C)(T/C)元件结合促进拟南芥次生壁的形成。

原核蛋白的表达是进行电泳迁移率试验的前期基础，因此获得高浓度与纯度的原核蛋白尤为关键。目前很难对植物体内某一特定蛋白进行提取，所以一般将其转入原核表达细胞中进行表达来收集蛋白，而植物的转录因子属于真核蛋白，在原核细胞中可能不表达或表达量很低，因此必须进行试验条件的摸索和优化才能使蛋白表达并获得高浓度与纯度的蛋白。本试验将白桦的一个MYB 转录因子BplMYB46 构建到原核表达载体pGEX-4T-2 上，利用IPTG 诱导重组蛋白的表达，并进行实验条件的摸索获得了浓度和纯度较高的重组蛋白，为后续的电泳迁移率试验提供了基础，从而能够分析MYB转录因子与顺式作用元件的互作，为进一步研究MYB 转录因子的功能提供一个新思路。

1 材料与方法

大肠杆菌感受态细胞Top10 为本实验室保存;原核蛋白表达载体pGEX4T-2(含有谷胱甘肽S 转移酶，glutathione S-transferase，GST 标签)购自GE Healthcare 公司;BamH I 和Not I 限制性内切酶购自Promega 公司;Ex Taq，dNTP 和T4 DNA 连接酶等购自TaKaRa 公司;质粒小提试剂盒、PCR 产物纯化试剂盒和胶回收试剂盒购自OMEGA 公司;其它试剂购自哈尔滨伊士达生物有限公司。

1.1 目的基因的扩增

根据BplMYB46 的基因序列特点和表达载体的限制性内切酶的识别位点设计引物，并在引物的正义链和反义链的5'端引入BamH I 和Not I 的酶切位点，引物序列为MYB-F:5'-GCGCGGATCCATGAGGAAGCCGGAGGCCT-3';MYB-R:5'-CATGGCGGCCGCCTGAACTTGGAAATCAAG-3';其中带有下划线的碱基表示酶切位点，为防止基因编码氨基酸时发生移码突变，带有方框的碱基是人为添加碱基序列。以pROK2-BplMYB46 质粒为模板，进行PCR 扩增，扩增体系为:10 ×Ex Taq buffer 2 μL，MYB-F 引物0.5 μL，MYB-R 引物0.5 μL，dNTP 0.4 μL，Ex Taq DNA 聚合酶0.2 μL，模板0.5 μL，去离子水补足体积至20 μL。反应程序:94 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30 个循环，72 ℃复性7 min。PCR 产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳检测，采用胶回收试剂盒对目的基因的片段进行纯化回收。

1.2 氨基酸序列分析

在白桦的转录组中发现BplMYB46 转录因子，利 用Expasy 在 线 工 具(http://www.expasy.org/tools/protparam.html)查找BplMYB46 蛋白的分子量和等电点;并利用Bioedit 软件将BplMYB46 与拟南芥的MYB 类转录因子进行氨基酸序列比对分析。

1.3 原核蛋白表达载体的构建

利用质粒小提试剂盒提取pGEX4T-2 的质粒，使用BamH I 和Not I 限制性内切酶对目的基因DNA 片段和pGEX4T-2 质粒分别进行双酶切，条件为37 ℃，6 h。然后采用PCR 产物纯化试剂盒将酶切后的目的基因和线性化载体进行纯化回收。然后利用T4 连接酶将BplMYB46 基因与pGEX4T-2线性化载体在16 ℃下过夜连接，次日，采用42 ℃热激法将连接液转入大肠杆菌Top10 感受态细胞中，于37 ℃倒置培养过夜。挑取平板上的单克隆菌落于LB 液体培养基(氨苄终质量浓度为50 mg/L)中进行活化，然后以菌液为模板进行PCR 检测，将阳性菌株对应的菌液送至上海生工生物技术有限公司(http://www.sangon.com/sangon)测序。提取测序成功对应的菌液的质粒，将其转入BL21 原核表达感受态细胞中，然后进行菌液PCR 检测，将检测成功的菌液保存到冰箱中-80 ℃备用。

1.4 重组蛋白的诱导表达

首先将保存于冰箱中的菌液在10 mL LB 液体培养基(氨苄终质量浓度为50 mg/L)中进行活化，37 ℃震荡培养箱中160 r/min 过夜培养。次日，在OD600为0.5，30 ℃培养温度下，IPTG(终浓度为0.5 mmol/L)分别诱导0、2、4、6 h，收集2 mL 菌液，4 ℃，12 000 r/min 离心5 min。弃上清，向沉淀中加入1 mL 的1x 上样缓冲液，振荡混匀，煮沸5 min，4 ℃，12 000 r/min 离心10 min，取上清进行SDS-PAGE电泳，同时以pGEX-4T-2 空载为对照。电泳结束后进行考马斯亮蓝染色，脱色后照相保存。

然后进行不同的IPTG 浓度0.2、0.4、0.6、0.8 mmol/L 的诱导，在30 ℃培养4 h，分别收集沉淀和上清进行SDS-PAGE 电泳;IPTG 浓度为0.4 mmol/L，分别在16、30、37 ℃培养温度下培养4 h，分别收集沉淀和上清进行SDS-PAGE 电泳。

1.5 重组蛋白的纯化

尿素溶解方式。沉淀用50 mL 2% Triton(PBS)重悬，振荡30 min，10 000 r/min 常温离心10 min，弃上清，沉淀用50 mL Buffer I(Buffer I:20 mmol/L Tris-HCl，5 mmol/L EDTA，100 mmol/L NaCl)重悬，超声波处理5 min，10 000 r/min 常温离心10 min，弃上清，沉淀用50 mL 2% Triton 重悬，振荡30 min，10 000 r/min 常温离心10 min，弃上清，沉淀用50 mL Buffer I 重悬，10 000 rpm 常温离心10 min，弃上清，沉淀用2、4 以及8 mol/L Urea/Buffer I 重悬，37 ℃过夜搅拌，SDS-PAGE 检测。

电洗脱方式。向沉淀中加入包涵体洗脱液，37℃振荡30 min，4 ℃下10 000 r/min 离心10 min，重复上述步骤3 次，将洗涤好的包涵体沉淀用溶解液充分溶解，在大板SDS-PAGE 中电泳，切下目的条带，置于透析袋中，加入蛋白洗脱缓冲液，4 ℃下120 V 电泳4 h，SDS-PAGE 检测。

2 结果与分析

2.1 BplMYB46 基因的PCR 扩增和序列分析

以pROK2-BplMYB46 重组质粒为模板，进行PCR 扩增。BplMYB46 基因的开放阅读框全长915 bp。BplMYB46 基因编码304 个氨基酸，分子量为34.4 kD，等电点为5.95。将BplMYB46 转录因子与拟南芥的MYB 类转录因子进行了氨基酸序列多重比对分析，拟南芥的MYB 转录因子包括AtMYB46、AtMYB85、AtMYB103、AtMYB52、AtMYB54、AtMYB43、AtMYB42、AtMYB69 和 AtMYB20 (GenBank ID:AED91824、NP_567664、AF048839_1、NP_173237、AEE35458、AED92315、NP_567390、AEE86226、NP_176797)，结果如图1所示。从图中可以看到，这些MYB 转录因子有2 个DNA 保守区，在第25 个氨基酸到第74 个氨基酸为一个R 区，第78 个氨基酸到124 个氨基酸为另一个R 区，所以BplMYB46 属于R2R3-MYB 类转录因子。

图1 白桦BplMYB46 转录因子与拟南芥MYB 类转录因子的氨基酸序列多重比对

2.2 BplMYB46 基因原核蛋白表达载体的构建

使用 BamH I 和 Not I 限制性内切酶将BplMYB46 基因PCR 扩增获得的胶回收产物和pGEX4T-2 质粒分别进行双酶切后，利用T4 连接酶将基因和载体的酶切产物进行连接，然后进行大肠杆菌转化试验。挑取单克隆活化后进行菌液PCR 检测，结果如图2所示。一共挑取6 个单菌落，以对应的菌液为模板，并以去离子水为阴性对照进行PCR 检测，目的条带为915 bp，从图2中可以看到扩增的片段大小接近1 kb，初步说明条带正确，将菌液测序后的序列与BplMYB46 基因序列进行比对，结果保持一致，说明原核蛋白表达载体构建成功。

图2 原核蛋白表达载体构建PCR 检测结果

2.3 BplMYB46 蛋白在原核中的表达

IPTG 终浓度为0.5 mmol/L，30 ℃160 r/min 分别诱导0、2、4、6 h 后，SDS-PAGE 检测结果如图3。BplMYB46 蛋白为34.4 kD，加上载体pGEX4T-2中的GST 标签蛋白26 kD，目的蛋白大约为60 kD。

从图3中可以看到2～4 号泳道的空载对照在26 kD 处有蛋白表达，6～8 号泳道在72 和45 kD 之间处有一条明显的不同于空载对照的条带，可能是目的蛋白。从图3中看到，在诱导时间为0 h(1，5号泳道)几乎没有蛋白的表达，随着诱导时间的延长，重组蛋白的表达量随之增加，但诱导4 和6 h(7，8 号泳道)的差别不大。所以后续试验诱导时间设为4 h。

图3 IPTG 诱导BplMYB46 蛋白表达检测

IPTG 浓度为0.2、0.4、0.6、0.8 mmol/L 进行诱导后，电泳结果如图4A。从图中可以看到，5～8 号泳道在72 和45 kD 之间有明显的条带，而1～4 号泳道没有相应的条带出现，说明重组蛋白主要以包涵体形式存在。当IPTG 浓度在0.4～0.8 mmol/L时重组蛋白表达量相差不多，说明IPTG 的浓度对重组蛋白表达量的影响不大，后续实验选择IPTG浓度为0.4 mmol/L 进行重组蛋白的诱导表达。

IPTG 浓度为0.4 mmol/L，分别在16、30、37 ℃培养温度下诱导培养4 h 后，电泳结果如图4B 所示。从图中可以看到，1～3 号泳道在72 和45 kD 之间有明显的条带，而4～6 号泳道没有相应的条带出现，重组蛋白仍以包涵体形式存在。诱导温度在30℃时重组蛋白的表达量较16 ℃时要高，在37 ℃时重组蛋白的表达量最高，但是杂蛋白的浓度也有所提高，所以后续实验选择30 ℃条件下诱导重组蛋白的表达。

图4 不同IPTG 浓度及温度下诱导BplMYB46 蛋白表达检测

2.4 BplMYB46 蛋白的纯化

2.4.1 尿素溶解方式进行蛋白纯化

以2、4 以及8 mol/L Urea/Buffer I 溶解沉淀后，SDS-PAGE 检测结果如图5，图中1 号、2 号和3 号泳道分别为2、4、8 mol/L 的Urea/Buffer I 溶解后的BplMYB46 蛋白，结果显示1 号泳道蛋白表达量很微弱，2 号泳道蛋白表达量较3 号低，3 泳道蛋白表达量最高，但仍含有杂蛋白。

2.4.2 电洗脱方式进行蛋白纯化

以电洗脱方式进行蛋白纯化后，SDS-PAGE 检测结果如图6，图中的1 号泳道为GST 标签蛋白，2号为30 ℃诱导的包涵体蛋白，3 号为包涵体复性，4号为电洗脱之后的蛋白，从图中可以看到经过电洗脱之后的目的蛋白浓度高，且较为单一，说明电洗脱效果较好。

图5 尿素溶解纯化蛋白检测

图6 电洗脱纯化蛋白检测

3 结论与讨论

电泳迁移率实验(EMSA)是一种研究DNA 结合蛋白和其相关的DNA 结合序列相互作用的技术，可用于定性和定量分析。目前，这一技术在转录因子与顺式作用元件的互作分析中被广泛的应用，而原核蛋白表达是研究转录因子与顺式作用元件互作的前期基础。陈雪燕等［13］对黑麦的ScMYB 的原核蛋白表达进行了各种影响因素的优化，结果显示IPTG 浓度对重组蛋白的表达无显著影响，诱导温度在37 ℃，诱导时间为4 h，菌液OD 值在0.6～1.0 时重组蛋白的表达量最高。刘胜男等［14］从柽柳中克隆一个bZⅠP1 基因，将其构建到pGEX-4T-2 载体上，通过条件优化发现IPTG 为1.0 mmol/L，37 ℃下诱导4 h，所获得重组蛋白rThbZIP1 表达量最大，利用电洗脱法纯化目的蛋白，为下一步研究bZIP1 转录因子蛋白活性及与特定元件结合的验证试验提供了基础。

本试验首先将白桦的一个MYB 转录因子—BplMYB46 构建到原核表达载体上，通过IPTG 诱导发现BplMYB46 表达蛋白为包涵体形式，采用尿素梯度透析法和电洗脱法进行试验条件的摸索和优化，结果显示电洗脱法得到的蛋白浓度和纯度较高。本研究为下一步利用EMSA 试验研究BplMYB46 与下游基因启动子上的顺式作用元件的互作提供了前期条件，从而为研究BplMYB46 在白桦中的功能做了充分的准备。

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