DNA回收试剂盒技术标准研究

周李华，叶德萍，王 智，谭和平

（中国测试技术研究院，四川 成都 610021）

DNA回收试剂盒技术标准研究

周李华，叶德萍，王 智，谭和平

（中国测试技术研究院，四川 成都 610021）

通过对DNA回收试剂盒质量标准现状研究以及国内外典型品牌DNA回收试剂盒的测试和比较分析，建议DNA回收试剂盒技术标准，包括柱子最大承载量、可承受最大质量、最小洗脱体积、最大容积、典型回收率等技术参数。这有助于统一规范DNA回收试剂盒技术指标，为建立DNA回收试剂盒技术标准奠定良好基础，对提高DNA回收试剂盒质量具有实际意义。

DNA回收；回收率；质量；技术标准

0 引 言

DNA回收纯化是分子生物学实验的重要一环[1]，是DNA检验的关键技术[2]。其试剂盒主要有离心柱型和磁珠型两种[3-6]，离心柱型主要是将硅胶膜固定在离心管中，通过离心力或者负压让含有核酸的溶液通过硅胶膜，使核酸在特定溶液环境中吸附在硅胶膜上，经过洗涤、洗脱等步骤得到纯的核酸。目前大多数回收试剂盒主要是采用该方法来回收核酸，这种方法操作简单、时间短。

1 DNA回收试剂盒质量标准研究现状

通过查阅国内外标准、产品说明书、分析报告（COA报告）以及对实际样品检测分析，对PCR纯化回收试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒等参数和指标进行了研究（见表1）。可见，各参数相差不大，都涵盖回收率、回收片段范围等主要参数。但大部分对DNA回收试剂盒还没有一个公认的统一评价方法，无国家标准，对指标要求尚不明确，各生产商根据生产、经营和品牌宣传的需要，在参数和指标上各成系统，如标示回收率有60%～95%不等。

表1 国内外DNA回收试剂盒技术标准参数比较表

2 DNA回收试剂盒标示参数尧指标的测试和比较分析

本试验根据典型品牌DNA回收试剂盒质控报告，从柱子最大承载量、DNA回收产物纯度、DNA回收率等关键指标对典型品牌的6种回收试剂盒进行了测试和比较分析。

2.1 试验部分

2.1.1 仪器与试剂

1）仪器

电泳系统（美国Bio-Rad）；凝胶成像系统（英国Syngene）；恒温水浴锅（德国Julabo）；冷冻离心机（德国Eppendorf）；超纯水机（美国Millipore）；超净工作台；紫外/可见光分光光度计（美国热电NanoDrop2000）。

2）主要试剂

DNA回收试剂盒（6个典型品牌）；DNA Fragment：10～30 000 bp（Fermentas）；λ-Hind III digest（Fermentas）；Lambda DNA （Fermentas）；Hind III（NEB）；T4 DNA Ligase（NEB）。

标准DNA溶液的配制：将不同的DNA Fragment（10～30000bp）用TE缓冲液配制成500ng/μL的DNA标准溶液备用。

2.1.2 方法

1）回收DNA片段

按照试剂盒说明书进行。

2）吸附柱的承载量测定

将500bp DNA Fragment溶液按照表2体系混合后加入吸附柱，测定其承载量。

表2 吸附柱承载量试验体系表

参照待测试剂盒说明书进行后续清洗、洗脱步骤，收集回收液，采用紫外分光光度计测定回收的DNA溶液在260 nm处的吸收值，得出回收DNA总量，以DNA上样量为横坐标绘制回收量曲线图，曲线上限即为吸附柱的承载量。重复测定3次，取平均值。

3）DNA回收产物的纯度测定

①采用紫外分光光度法。以洗脱液做参比，将试剂盒回收得到的DNA溶液，根据GB/T 30988——2014《多酚类植物基因组DNA提取纯化及测试方法》中方法测定样品溶液吸收值，并判断其纯度。同时，将回收得到的DNA溶液，在1.0%的琼脂糖凝胶上样电泳，电泳结束后可在凝胶成像系统上观察回收DNA纯度及降解程度。

②酶切回收再连接试验。λ DNA酶切产物制备和连接反应参照文献[7]文献进行。酶切和连接产物经1.0%琼脂糖凝胶上样电泳，按照试剂盒说明书方法回收DNA。

4）回收率和浓度测定

将10～30 000 bp不同长度片段的标准溶液进行琼脂糖凝胶电泳，同时用双蒸水进行空白对照。电泳完成后在紫外凝胶成像仪上观察DNA条带的位置，分别用刀片切下各目的条带用于胶回收。回收步骤、操作流程和试剂用量参照待测试剂盒说明书进行。

符合纯度要求的回收产物，采用紫外分光光度计，依据GB/T 30988——2014方法测定和计算浓度，重复测定3次，取平均值。同时，采用泳带强度分析法，测定回收前后DNA溶液在1.0%琼脂糖凝胶中电泳谱图的强度值，根据强度的比值得出回收率。重复测定3次，取平均值。

2.2 结果与分析

2.2.1 吸附柱的最大承载量比较

图1为两个品牌的DNA凝胶回收试剂盒最大承载量测试图，从图上可知，品牌1回收试剂盒吸附柱最大承载量约为30μg，达到说明书指标40μg的75%。而品牌2吸附柱最大承载量约为10μg，只能达到说明书指标20μg的50%。

图1 最大承载量比较图

本试验选取500bp的DNA标准溶液对最大承载量进行测试，该片段是各个试剂盒基本涵盖的典型回收片段，回收率原则上能达到说明书标示指标。结果显示，待测试剂盒回收量与试剂盒的最大承载量相关性很大，不是上样量越多，回收量越高。而是在柱子最大承载量范围内，上样量越多，回收量越高。

表3 各品牌回收试剂盒纯度测定

2.2.2 DNA回收产物纯度比较

由表2可知，各品牌的A260/A280，A260/A230， A260/A270的比值比较理想，表明严格按照试剂盒试验步骤和注意事项操作，纯度基本合格，部分试剂盒回收产物含有少量杂质。从图2和图3可看出，回收片段完整性好，能较好的用于后续连接等操作过程，可以满足后续试验要求。

图2 DNA回收片段电泳图谱

图3 酶切回收连接试验电泳图谱

2.2.3 DNA回收率比较

本试验对不同片段长度的DNA标准溶液进行回收，综合评价试剂盒的回收率。从图4可知，高回收率集中在100～10 000 bp之间，500～5 000 bp之间为典型片段，低于100bp和高于10000bp回收率迅速下降，试验用试剂盒一般能达到标示回收率的60%，部分试剂盒在典型片段范围可超过标示指标的90%，经测定平均回收率约为40%，达不到标识指标的70%。

图4 不同试剂盒回收率比较图

图5 品牌5单一DNA片段回收电泳图谱

表4 DNA回收试剂盒技术标准建议表

图6 品牌6混合DNA片段回收电泳图谱

图7 品牌1和2单一DNA回收电泳图谱

图8 品牌1和2混合DNA回收电泳图谱

从图5～图8的电泳图谱，借助凝胶软件分析的谱带强度值，得出的回收率与紫外分光法检测得出的回收率相当。

3 DNA回收试剂盒质量标准建议

试剂盒法是一种常用的DNA回收方法，也是目前许多实验室回收DNA的主要方法。因需求量大，试剂盒产业发展迅速，品种多样，但有大部分试剂盒效果不甚想理。相关部门并未对其产品质量技术指标进行规定，所以当前试剂盒市场比较混乱，良莠不齐，为了试剂盒产业的健康发展，急需建立试剂盒质量评价的指导性标准。笔者通过分析测试建议DNA回收试剂盒的质量指标指标如表4所示。

4 结束语

根据实验目的不同，回收的DNA可用于载体连接、基因重组、序列分析、探针制备等后续工作。回收的DNA产物质量和回收率，是影响后续试验进程的关键。在抗体库的构建过程中，DNA回收效率的高低对所构建抗体库的质量有十分重要的意义[8]。回收的DNA片段质量达不到要求，后续试验就无法进行。本试验通过对6个典型品牌回收试剂盒的回收率和回收产物质量等指标进行测试，结果表明有大部分试剂盒，回收率和回收效果不甚想理，达不到产品标识指标，这与周君等[1]得出的结论一致。大部分回收试剂盒达不到说明书中的技术指标（70%以上），妨碍了后续操作的进行，特别是回收一些大片段（如14×103bp的载体）时回收率更低。

通过对DNA回收试剂盒质量标准的现状进行调查研究，对典型品牌DNA回收试剂盒进行测试和比较分析，建议了柱式DNA回收试剂盒质量指标，兼顾了试剂盒的回收率、回收纯度、回收片段范围等关键指标的普适要求和寡核苷酸等特殊指标应用适应性要求，同时对柱子最大承载量、最大容积、最大质量和最小洗脱体积等辅助指标进行了规定，建议参数显著增加，质量指标达到国际先进水平。一定程度上解决了DNA回收试剂盒产品质量标准无据可依的关键技术问题，为建立DNA回收试剂盒质量测定标准奠定基础，对促进试剂盒质量的提升具有重要意义。

[1]周君，陈正凯，徐剑，等.琼脂糖凝胶中DNA回收技术的探讨[J].常熟理工学院学报：自然科学版，2007，21（8）：43-47.

[2]杨百全，王利君，遇长青，等.磁珠法回收纯化DNA样本[J].中国法医学杂志，2006（21）：10-11.

[3]杨百全，陈霞.纳米科技与法医DNA检验[J].刑事技术，2003，161（4）：29-31.

[4]王林生，苏勇，顾林岗.硅珠法提取PCR模板DNA[J].中国法医学杂志，2000，15（1）：36-37.

[5]郭景元，李伯龄.中国刑事科学技术大全-法医物证学分册[M].北京：中国人民公安大学出版社，2002：21.

[6]刘开会，王传海，周静，等.汗潜指印DNA提取方法的初步研究[J].刑事技术，2002，147（3）：12-13.

[7]周李华，叶德萍，王智，等.T4DNA连接酶活力检测方法[J].中国测试，2014，40（2）：64-66.

[8]苏明，窦科峰，赵爱志，等.提高柱式胶回收试剂盒DNA回收效率的最佳条件[J].第四军医大学学报，2002，23（6）：505-508.

Study on technical standard of DNA extraction Kit

ZHOU Lihua，YE Deping，WANG Zhi，TAN Heping
（National Institute of Measurement and Testing Technology，Chengdu 610021，China）

Through the present situation study of the quality standard of DNA Extraction Kits，and Analysis of DNA Extraction Kits of domestic and foreign factories.DNA Extraction Kit technicalstandard were advised.This helps to unified standard ofDNA Extraction Kit technology index and imported DNA Extraction Kits quality.It is also lays a foundation for the DNA Extraction Kit quality measurement standard.

DNA extraction；DNA recovery；quality；technical standard

A

：1674-5124（2015）07-0051-04

10.11857/j.issn.1674-5124.2015.07.012

2015-01-09；

：2015-02-24

周李华（1978-），女，湖南茶陵县人，硕士，主要从事测试技术与标准研究。