慢性高眼压大鼠视网膜线粒体复合物活性与氧化应激的动态变化研究△

高凤娟 孙兴怀 陈君毅 张圣海 张懿 高凤 吴强 吴继红

·基础研究·

慢性高眼压大鼠视网膜线粒体复合物活性与氧化应激的动态变化研究△

高凤娟＊孙兴怀 陈君毅 张圣海 张懿 高凤 吴强＊吴继红

目的研究慢性高眼压大鼠视网膜5个线粒体呼吸链复合物(MRCCs)活性及氧化应激的动态变化，探索高眼压视网膜氧化损伤机制，为进一步阐明青光眼视神经损害的复杂分子机制提供实验数据。方法挪威鼠前房注射磁珠建立慢性高眼压模型。分别在术后0、1、2、4周，视网膜冷冻切片检测活性氧(ROS)含量；制备视网膜组织匀浆，检测5个MRCCs、总超氧化物歧化酶(T-SOD)、铜/锌-超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)、锰-超氧化物歧化酶(Mn-SOD) 活性及丙二醛(MDA)含量变化。使用 SPSS16.0 统计软件分析处理数据。结果挪威鼠前房磁珠注射后眼压较注射前及对照组均显著升高；慢性高眼压后，MRCCⅠ、Ⅱ、Ⅲ活性迅速显著降低，以MRCC Ⅲ 下降幅度最大(P<0.01)；MRCCⅣ、Ⅴ的活性在第1周短暂升高后也显著降低(P<0.01)；T-SOD、Cu/Zn-SOD 活性在前2周升高，到4周时显著降低(P<0.05)，Mn-SOD 活性在眼压升高后即迅速大幅度降低(P<0.05)；高眼压组视网膜MDA及ROS含量显著增加(P<0.001)。结论慢性高眼压引起视网膜MRCCs活性及抗氧化能力下降，导致线粒体功能障碍、视网膜ROS及氧化产物增加等损伤性变化。(中国眼耳鼻喉科杂志，2015，15：379-383)

慢性高眼压模型；线粒体复合物活性；氧化应激；超氧化物歧化酶；丙二醛；活性氧；大鼠

青光眼视神经病变是全球第1位不可逆性致盲眼病[1-2]。到目前为止，引起青光眼视神经损害的机制尚不十分清楚，但是大量研究[3-4]已经证实，氧化应激在青光眼视神经病变中起着至关重要的作用。然而青光眼视神经病变中，有关氧化应激产生的原因及具体机制鲜有深入研究。线粒体呼吸链是细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)产生的主要位点，是氧化应激的根源[5]，提示线粒体在青光眼视神经病变氧化损伤中起关键作用[6]。我们的前期体外研究证实：压力可以引起体外培养的视网膜星形胶质细胞(retina astrocytes, RA)线粒体形态和功能异常，导致RA内ROS增加以及抗氧化能力下降等损伤性变化；体内试验发现：慢性高眼压大鼠视网膜神经节细胞中线粒体DNA损伤及突变增加[7]，但是在慢性青光眼动物模型中，线粒体呼吸链复合物(mitochondrial respiratory chain complexes，MRCCs)的功能及氧化应激的动态改变如何呢？为此本研究系统探讨慢性高眼压动物模型视网膜5个MRCCs活性及氧化应激的动态变化，进一步探索慢性高眼压视网膜氧化损伤的机制。

1 材料与方法

1.1 挪威大鼠慢性高眼压模型建立及分组 22周龄健康雄性挪威大鼠，由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供。符合国家医用动物使用标准，标准号为清洁级，检证字:SCXK 沪 2008-0016 (上海市实验动物质量合格证号)。室温下10%水合氯醛注射挪威大鼠腹腔致全身麻醉(0.3 mL/100 g)，用33-G微量注射器抽取6～8 μL 50 mg/mL的超顺磁性氧化铁，缓慢推入前房。用小磁铁吸附注入前房的磁珠，在眼周围轻轻移动小磁铁，使磁珠在眼前房均匀分散开，阻塞小梁网。右眼不作处理。将2组挪威大鼠分别于术前1 d及术后1、3、5、7、14、21、28 d给予测眼压，每日上午8:30～10:00用Tono-Pen XL测量眼压，取3次可信测量值(变异概率≤5%)的平均眼压。每日术眼滴左氧氟沙星滴眼液1次，连续滴1周；每日显微镜下观察结膜、角膜、前房的炎症情况。模型成功的判断标准：眼压>21 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)或眼压高于非手术眼5 mm Hg，且高眼压连续持续7 d以上为造模成功[8]。选取18只造模成功鼠(左眼)纳为实验组，18只正常挪威大鼠(左眼)为对照组。

1.2 ROS含量测定 高眼压2周及同龄挪威大鼠麻醉处死后，快速取出眼球，立即放入预冷的磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline ,PBS)中漂洗，剪除角膜，剜除晶状体，包埋剂混合物(opti-mum cutting temperature compound， OCT)进行组织包埋；-80 ℃冰箱冷冻包埋1 h后，用冷冻切片机制备厚约10 μm的视网膜冷冻切片，将切片置于载玻片上。按照冷冻切片氧化应激ROS高质荧光测定试剂盒说明书加入ROS染色液。荧光显微镜下观察ROS水平并拍照。

1.3 视网膜组织匀浆的制备 高眼压0、1、2、4周及同龄对照组挪威大鼠处死，立即摘取眼球，分离视网膜，加入匀浆介质(0.9%生理盐水+1%苯甲基磺酰氟)超声破碎,制备成10%的组织匀浆。根据二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白测定试剂盒(碧云天)说明书测定蛋白浓度。

1.4 MRCCs活性测定 利用MRCCs活性定量检测试剂盒(上海杰美基因医药科技有限公司)检测MRCCs活性。检测步骤按试剂盒说明，启动反应后，应用多功能酶标仪(美国Bio-tak)在相应波长下扫描，通过计算求出各样品的MRCCs活性(μmol·min-1·mg-1)。1.5 SOD活性及MDA含量测定 应用SOD分型试剂盒及MDA试剂盒(南京建成生物工程研究所)，严格按照试剂盒说明书，采用黄嘌呤氧化酶法测定550 nm处吸光度值，通过计算可求出被测样品中SOD活力 (U/mgpro)。MDA含量测定在532 nm处有最大吸收峰，单位为nmol/mgprot。

2 结果

2.1 眼压 25只挪威大鼠术前平均眼压为(10.60±0.42)mm Hg，前房磁珠注射1周后有23只鼠眼压较对照组显著升高(P<0.001)，平均眼压为(37.00±5.46)mm Hg，造模成功率为92%；术后2、3、4周后平均眼压为(33.50±3.58)、(30.60±3.95)、(25.00±4.20)mm Hg，均较对照组显著升高(P<0.01)(表1、图1)。

表1 2组挪威大鼠的术前及术后眼压(mm Hg)

注：与正常对照组相比，a示P<0.01，b示P<0.001

2.2 慢性高眼压挪威大鼠视网膜5个MRCCs的活性动态变化 2组挪威大鼠各时间点5个MRCCs的活性见表2。与正常对照组相比，MRCCⅠ、Ⅱ、Ⅲ的活性在眼压升高第1周即显著降低，分别下降了32.61%(P<0.01)、69.61%(P<0.01)、80.33%(P<0.01)，随后MRCCⅠ的活性继续降低，到第4周时已降低了65.63%，而MRCCⅡ、Ⅲ到第4周时有轻度回升，但仍显著低于正常对照组(P<0.01)；MRCCⅣ、Ⅴ的活性在眼压升高第1周时分别增加了38.19%、7.11%(P<0.05)，但随后迅速降低，到第4周时分别降低了37.19%(P<0.01)、65.63%(P<0.001)(图2)。

图1. 挪威大鼠前房磁珠注射后眼压变化 NC为正常对照组，COH为慢性高眼压组；与正常对照组相比，**示P<0.01，***示P<0.001

表2 2组挪威大鼠各时间点5个MRCCs的活性(μmol·min-1·mg-1)

注：与正常对照组相比，a示P<0.05，b示P<0.01，c示P<0.001

图2. 各组挪威大鼠不同时间点5个MRCCs的活性变化 NC为正常对照组，COH为慢性高眼压组； 与正常对照组相比，*示P<0.05，**示P<0.01，***示P<0.001

2.3 各组视网膜组织SOD活性及MDA含量动态变化 各组挪威大鼠不同时间点视网膜组织SOD活性及MDA含量见表3。由图3可以看出，慢性高眼压大鼠视网膜T-SOD、Cu/Zn-SOD活性在术后前2周是升高的，到第2周时分别升高了24.14%、56.28%(P<0.01)，到眼压升高第4周时才显著低于对照组，其中T-SOD降低了38.85%(P<0.001),而Cu/Zn-SOD仅降低了19.58%(P<0.05)；然而位于线粒体内的Mn-SOD在眼压升高第1周即迅速降低，到第4周时已经降低了75.68%(P<0.05)。视网膜组织内的MDA含量在慢性高眼压后即逐渐升高，到第2周时已显著增加了2.03倍(P<0.001)。

2.4 慢性高眼压视网膜组织ROS含量变化 为了进一步验证慢性高眼压挪威大鼠视网膜内氧化应激的存在，我们又在视网膜冷冻切片上原位检测了ROS的含量变化。正置荧光显微镜观察(图4)，ROS呈绿色荧光。慢性高眼压大鼠视网膜各层内均可见绿色荧光，且荧光强度显著高于对照组。

表3 SOD活性(U/mgpro)及MDA含量(nmol/mgprot)

注：与正常对照组相比，a示P<0.05，b示P<0.01，c示P<0.001

图3. 各组挪威大鼠不同时间点视网膜T-SOD、Cu/Zn-SOD、Mn-SOD活性及MDA含量变化 NC为正常对照组，COH为慢性高眼压组；与正常对照组相比，*示P<0.05，**示P<0.01，***示P<0.001

图4. 挪威大鼠慢性高眼压(COH)2周及同龄对照组(NC)视网膜冷冻切片原位ROS检测的荧光照片 绿色荧光标记为ROS，蓝色荧光为细胞核(×10)

3 讨论

科学有效地构建动物模型是进行实验研究首要的必需条件，我们将磁珠注射至挪威鼠前房以阻塞小梁网达到眼压升高的目的，成模率高，操作相对简单，对眼部损伤较小，并发症少，单次注射眼压升高可持续2周；且通过2次磁珠注射可以使眼压升高持续8周甚至更长[9]，可以排除眼压波动对实验结果的干扰，使得结果更加科学、可信。

MRCCs主要由5个酶复合物(复合物Ⅰ～Ⅴ)构成，是合成ATP和产生ROS的重要场所[10]。本研究动态监测了慢性高眼压1、2、4周后大鼠视网膜5个MRCCs的活性变化，结果显示5个MRCCs的活性均显著降低，提示慢性高眼压作用下视网膜MRCCs功能出现异常。其中MRCC Ⅰ～Ⅲ的活性在眼压升高后立即下降，且以MRCC Ⅲ下降幅度最大，提示MRCCⅢ可能对压力损伤最敏感，很可能是压力作用于线粒体损伤的始动部位。MRCCs活性下降进一步导致ROS产生增加，氧化损伤加重，如此形成恶性循环，启动视网膜内引起细胞死亡的级联反应。但是MRCC Ⅳ和Ⅴ的活性在眼压升高第1周时有短暂升高，这可能与它们的代偿能力较强、对压力损伤的敏感度较低有关，且它们并不是产生ROS的原发部位，只有当ROS累积到一定水平并超出其代偿能力后，才产生明显的损伤作用，表现为活性下降。

SOD是视网膜抗氧化系统的主要成分之一，细胞内的SOD分为2型：Cu/Zn-SOD和Mn-SOD。前者主要位于细胞质内，而后者主要位于线粒体基质内，是线粒体内清除自由基最重要的抗氧化酶[11-12]。因此，检测SOD的活性可以很好地反映机体抗氧化系统的损伤情况。MDA是脂质过氧化反应的主要终产物，其含量的测定间接反映了细胞受自由基攻击的脂质过氧化程度[13]。我们的研究显示，T-SOD、Cu/Zn-SOD活性在眼压升高前2周代偿性升高，然而MDA和ROS含量在眼压升高后即显著升高，提示SOD活性的升高并没有完全代偿以清除压力损伤产生的过多ROS。于是我们检测线粒体内的主要抗氧化酶Mn-SOD，结果显示，其活性在眼压升高后迅速大幅度降低。根据文献报道，Mn-SOD在线粒体的抗氧化系统中发挥非常基础但重要的作用，且其在线粒体内的含量非常低。当其活性下降后，将对线粒体的抗氧化能力产生严重影响，致其功能障碍甚至崩解[14]。因此我们考虑慢性高眼压时，视网膜线粒体内抗氧化系统的损伤均较早、较严重，且由于MRCCⅢ活性降低产生大量ROS，导致线粒体内很早即出现氧化应激损伤，并形成恶性循环，进而导致细胞损伤、功能障碍。

本研究提示，慢性高眼压时线粒体功能障碍、MRCCⅢ活性下降及线粒体内抗氧化系统损伤与视网膜氧化应激损伤密切相关，因此专门用于提升线粒体MRCCⅢ及抗氧化活力的、有特定作用靶点的作用剂研究，很可能会对青光眼这类疾病有一定的帮助。这也将是今后青光眼领域工作者研究的一个方向，将对青光眼的早期诊断及干预带来新思路。 此外，本研究也为青光眼视神经病变机制的研究奠定了一定的理论基础和实验依据，为进一步的研究提供了新的方向。

[1] Son JL,Soto I,Oglesby E, et al. Glaucomatous optic nerve injury involves early astrocyte reactivity and late oligodendrocyte loss[J]. Glia,2010,58(7):780-789.

[2] Quigley HA,Broman AT.The number of people with glaucoma worldwide in 2010 and 2020[J]. Br J Ophthalmol ,2006,90(3): 262-267.

[3] Rayner CL, Gole GA, Bottle SE, et al. Dynamic,invivo, real-time detection of retinal oxidative status in a model of elevated intraocular pressure using a novel, reversibly responsive, profluorescent nitroxide probe[J]. Experimental Eye Research, 2014, 129: 48-56.

[4] Nahirnyj A, Livne-Bar I, Guo X, et al. ROS detoxification and proinflammatory cytokines are linked by p38 MAPK signaling in a model of mature astrocyte activation[J]. PloS One,2013, 8(12):e83049.

[5] 高凤娟, 吴继红,孙兴怀. 线粒体功能异常与青光眼的关系[J]. 国际眼科纵览, 2012,36(5):302-306.

[6] Kong GY, Van Bergen NJ, Trounce IA, et al. Mitochondrial dysfunction and glaucoma[J].J Glaucoma,2009, 18(2):93-100.

[7] Wu JH, Zhang SH, Nickerson JM, et al. Cumulative mtDNA damage and mutations contribute to the progressive loss of RGCs in a rat model of glaucoma[J]. Neurobiol Dis, 2015 ,74: 167-179.

[8] Samsel PA, Kisiswa L, Erichsen JT, et al. A novel method for the induction of experimental glaucoma using magnetic microspheres[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2011, 52(3):1671-1675.

[9] Sappington RM, Carlson BJ, Crish SD, et al. The microbead occlusion model: a paradigm for induced ocular hypertension in rats and mice[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci,2010,51(1):207-216.

[10] Jezek P, Hlavata L. Mitochondria in homeostasis of reactive oxygen species in cell, tissues, and organism [J]. Int J Biochem Cell Biol, 2005, 37(12):2478-2503.

[11] Melov S, Coskun P, Patel M, et al. Mitochondrial disease in superoxide dismutase 2 mutant mice[J]. P Natl Acad Sci USA, 1999, 96(3): 846-851.

[12] Lee HP, Pancholi N, Esposito L,et al. Early induction of oxidative stress in mouse model of alzheimer disease with reduced mitochondrial superoxide dismutase activity[J]. PloS One, 2012, 7 (1) :e28033.

[13] Freitinger Skalická Z, Zölze F, Beránek L,et al. Indicators of oxidative stress after ionizing and/or non-ionizing radiation: superoxid dismutase and malondialdehyde[J]. J Photochem Photobiol B, 2012,117: 111-114.

[14] MacMillan-Crow LA, Thompson JA. Tyrosine modifications and inactivation of active site manganese superoxide dismutase mutant (Y34F) by peroxynitrite[J]. Arch Biochem Biophys,1999, 366(1):82-88.

(本文编辑 诸静英)

Dynamic changes of the mitochondrial complexes activities and oxidative stress in the retinas of chronic ocular hypertension rat models

GAOFeng-juan＊,SUNXing-huai,CHENJun-yi,ZHANGSheng-hai,ZHANGYi,GAOFeng,WUQiang＊,WUJi-hong.

DepartmentofOpthalmology,EyeEarNoseandThroatHospitalofFudanUniversity,Shanghai200031,China

WU Ji-hong, Email: jihongwu@fudan.edu.cn

Objective To investigate the dynamic changes of the all mitochondrial respiratory chain complexes (MRCCs) activities and levels of oxidative stress of the retina, and to reveal the mechanism of oxidative stress injury in retina of high intraocular pressure (IOP) which would provide experimental data for further clarification of the complex molecular mechanisms of glaucoma optic nerve damage. Methods Chronic ocular hypertension was induced by injecting magnetic beads in the anterior chamber of Brown Norway rats. Tissue homogenate of retinas were obtained at different time point of high IOP. Biochemical methods were used to test the activities of all MRCCs, total superoxide dismutase(T-SOD), Cu/Zn-SOD, Mn-SOD and the content of malondialdehyde (MDA) and reactive oxygen species (ROS). Statistical analysis was performed by using SPSS16.0. Results A sustained IOP increase was achieved in 92% of Brown Norway rats. MRCC Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ activities decreased when IOP was elevated(P<0.01) and MRCC Ⅲ declined with the greatest fall range; MRCC Ⅳand Ⅴ increased in the first week but declined rapidly then(P<0.01). Activities of T-SOD and Cu/Zn-SOD increased in the first two weeks before they declined(P<0.05), while Mn-SOD activities showed a sharply downward trend(P<0.05); Mount of MDA and ROS was significantly increased in the chronic ocular hypertension group. Conclusions Chronic ocular hypertension leads to reduction of MRCCs activities and antioxidation ability in the retina which directly results in mitochondrial dysfunction and overproduction of ROS and MDA. (Chin J Ophthalmol and Otorhinolaryngol,2015,15:379-383)

Chronic high intraocular pressure model; Mitochondrial complex activity; Oxidative stress; Superoxide dismutase; Malondialdehyde; Reactive oxygen species; Rat

国家自然科学基金(81470624, 81470625, 81470623)；上海市卫生局局级科研项目(20124073)

复旦大学附属眼耳鼻喉科医院眼科 上海 200031；＊上海市第六人民医院眼科 上海 200030

吴继红(Email：jihongwu@fudan.edu.cn)

10.14166/j.issn.1671-2420.2015.06.001

2015-04-27)