血清胰蛋白酶原-2对肝细胞癌的诊断价值

赵书云，赵 洁，刘 杰，吕玉琴，张海霞，李 晗，谷凌云，郭汉斌，曹建彪

肝细胞癌(hepatic carcinoma，HCC)是我国常见的消化系统恶性肿瘤之一，病死率高，在恶性肿瘤死亡顺位中仅次于胃癌［1-3］。据统计，全球每年新患HCC人数为62.6万人，死亡人数则高达59.8万人，新发HCC病例中55%发生于中国［4］。循证医学数据充分表明，早期诊断HCC并给予有效的治疗将会明显延长生存期［5］。肿瘤标志物血清学检测已经在临床广泛应用于恶性肿瘤早期诊断、预后判定和疗效评价等方面，而新肿瘤标志物研究已成为全球的热点。本研究采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测HCC患者血清中胰蛋白酶原-2(Try-2)含量，探讨其用于HCC诊断的可行性。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2012年6—12月北京军区总医院全军肝病治疗中心收治的经病理学、影像学确诊为HCC 34例，均符合2011年版《原发性肝癌诊疗规范》诊断标准:发病＜1年，未经药物及手术治疗。男22例，女12例;平均年龄58.2岁。选择同期经超声、CT等诊断的发病＜1年、未经药物系统治疗的乙型肝炎肝硬化30例，男19例，女11例;平均年龄61.9岁。选择同期诊断为慢性乙型肝炎者30例，男20例，女10例;平均年龄51.6岁。以上病例均无明显上消化道症状及胰腺疾病病史，无严重心、肺、肝、肾和神经、精神疾病等，并排除孕妇、酗酒者、药物成瘾者。3种疾病患者性别、年龄等方面比较差异无统计学意义(P＞0.05)，具有可比性。

1.2 方法 所有研究对象留置空腹静脉全血4 ml，标本当日或于2～8℃冷藏保存至次日离心后取上清液分装置于-70℃冻存，统一采用ELISA法定量检测血清中Try-2的含量。血清Try-2检测试剂盒由上海卡努生物技术有限公司提供，采用美国BIORAD Model550酶标仪分析，试验方法严格按照试剂盒说明书进行。

1.3 统计学方法 采用SPSS 16.0统计软件进行分析，计量资料以均数±标准差(x±s)表示，偏态分布数据采用非参数Kruskal-Wallis H检验，组间两两比较采用Bonferroni法，α=0.05为检验水准。应用受试者操作特征曲线(ROC)确定检测指标的临界值并对其进行诊断效率评价。

2 结果

2.1 血清Try-2浓度 HCC、乙型肝炎肝硬化和慢性乙型肝炎血清Try-2含量分别为(12.86±3.90)、(8.30±1.22)及(5.70±2.15)μg/L。经正态性检验发现，数据呈偏态分布，故分别计算出其中位数、四分位间距、全距，三者血清Try-2含量比较差异有统计学意义(Chi-Square值为12.443，P＜0.05)。其中两两比较血清Try-2含量差异均有统计学意义(P ＜0.05)，见表1。

表1 3种疾病血清胰蛋白酶原-2含量(μg/L)

2.2 血清Try-2鉴别HCC、慢性乙型肝炎ROC曲线 用血清Try-2鉴别HCC、慢性乙型肝炎的cut-off值，得出最佳临界值为7.30μg/L，此时对应的灵敏度和特异度分别为89.11%和81.32%。血清Try-2 ROC曲线下面积小于AFP，但无统计学差异(P＞0.05)。见图 1，表 2。

图1 血清胰蛋白酶原-2和甲胎蛋白在鉴别肝细胞癌和慢性乙型肝炎的ROC曲线

表2 血清胰蛋白酶原-2和甲胎蛋白在鉴别肝细胞癌和慢性乙型肝炎ROC曲线下面积

2.3 血清Try-2鉴别HCC、乙型肝炎肝硬化的ROC曲线 HCC血清Try-2含量高于乙型肝炎肝硬化，设定敏感度最低限值为80%，寻找不低于该限值的最大特异度的切点作为最佳工作点。用血清Try-2鉴别HCC、慢性乙型肝炎的cut-off值，得出最佳临界值为8.18μg/L，此时对应的灵敏度和特异度分别为85.30%和63.32%。血清Try-2 ROC曲线下面积小于AFP，差异显著(P＜0.05)。见图2，表3。

图2 血清胰蛋白酶原-2和甲胎蛋白在鉴别肝细胞癌和慢性乙型肝炎的ROC曲线

表3 血清胰蛋白酶原-2和甲胎蛋白在鉴别肝细胞癌和慢性乙型肝炎ROC曲线下面积

3 讨论

胰蛋白酶原是胰蛋白酶的前体，是一种分子量为25 kD的蛋白酶，其由两种同工酶组成，包括Try-1(阳离子型)和Try-2(阴离子型)两种亚型，除分布于人类皮肤、消化道、肺、肾、肝和胆管的上皮细胞外，在一些肿瘤细胞中胰蛋白酶原也存在较高表达，如胰腺癌、胆管癌、卵巢肿瘤、胃癌、结直肠肿瘤等［6-7］。在许多恶性肿瘤及培养的肿瘤细胞系中高表达的Try-2称为肿瘤相关性Try-2，经氨基酸测序检测，肿瘤细胞来源的Try-2与胰腺腺泡细胞分泌Try-2 序列相同［8-9］。

Try-2可直接或间接引起肿瘤周围基质蛋白水解而形成肿瘤侵袭，活化后Try-2可降解细胞外基质，且能作为一种生长刺激因子，激活受体-2，促进细胞增殖转移。正常情况下，血液中只有少量Try-2表达，当受体某些组织受到恶性肿瘤破坏时，Try-2大量入血，血中Try-2含量明显升高［10］。本研究结果显示，HCC患者血清中的Try-2含量高于慢性乙型肝炎、乙型肝炎肝硬化患者，与前述报道相似。

目前国内关于Try-2与HCC及肝硬化的关系尚无较明确的研究，其判断临界值也存在较大差异，Itkonen［11］和 Largman 等［12］采用放射免疫法检测正常组血清Try-2含量均值分别为17.0和4.5μg/L，而Kimland等［13］采用 ELISA检测血清 Try-2均值为21μg/L，这可能与标准化抗原的制备、检测方法、人群种族、年龄、性别等因素有关。

迄今为止，血清AFP仍是临床检测HCC时使用最广泛的肿瘤标志物之一，其在临床应用时间长，检测方法成熟、简便，在高危人群筛查方面有一定的优势，但也存在着许多不足，如特异度和灵敏度的问题［14］，当AFP诊断阈值设定为20μg/L时，其诊断预测灵敏度为67.2%，而特异度为29.2%;当AFP诊断阈值设定为400μg/L时，其诊断预测灵敏度太低(42.8%)而无法在临床使用［15-17］。本研究绘制的血清Try-2鉴别诊断HCC和慢性乙型肝炎ROC曲线时，得出最佳临界值为7.30μg/L，此时对应的灵敏度和特异度分别为89.11%和81.32%，提示此临界值兼顾了灵敏度和特异度。在鉴别诊断HCC与乙型肝炎肝硬化时，需要较高的灵敏度，以便筛查HCC进行下一步诊治，故设最低灵敏度为80%，选取不低于该限值的最大特异度的切点，最佳临界值为8.18μg/L，此时对应的灵敏度和特异度分别为85.30%和63.32%。根据试验结果，当血清Try-2＞7.30μg/L时，应考虑可能存在肝脏疾患，而当Try-2＞8.18μg/L时，患HCC的可能性较大，应给予进一步影像学等检查以明确诊断，或密切随访。此外，有文献报道，血清Try-2异常增高亦可存在于多种肿瘤组织［6-7］，也应注意结合临床表现或特异性检查，以便与HCC鉴别。

无论鉴别HCC与慢性乙型肝炎，还是HCC与乙型肝炎肝硬化，血清Try-2 ROC曲线下面积均小于AFP。血清Try-2与优化后AFP比较，其诊断效率都不优于AFP，其中鉴别HCC与慢性乙型肝炎时差异不显著，而在鉴别HCC与肝硬化时差异显著。

综上所述，血清Try-2与HCC具有良好相关性，其ELISA检测可作为一种非侵入性的初筛试验，其检测方法简便、经济，对HCC具有较好的灵敏度和特异度，或可作为平行指标弥补其他肿瘤标志物，对临床初筛HCC有一定的价值。

［1］ 杜经丽，韦立新.原发性肝细胞癌的诊断及相关基因研究进展［J］.武警医学院学报，2011，20(12):1004-1008.

［2］ 卢鹏，李霄，窦科峰，等.热休克转录因子1蛋白在人肝细胞癌组织中的表达及临床意义［J］.中华消化外科杂志，2012，11(3):279-283.

［3］ 丁峰，张代军，宋蜀伶，等.抗p21Ras单克隆抗体KGHR与肝细胞肝癌及正常肝组织的免疫反应性研究［J］.解放军医药杂志，2012，24(4):5-8.

［4］ Parkin D M，Bray F，Ferlay J，et al.Global cancer statistics，2002［J］.CA Cancer JClin，2005，55(2):74-108.

［5］ Trinchet JC，Alperovitch A，Bedossa P，et al.Epidemiology，prevention，screening and diagnosis of hepatocellular carcinoma［J］.Bull Cancer，2009，96(1):35-43.

［6］ Paju A，Vartiainen J，Haglund C，et al.Expression of trypsinogen-1，trypsinogen-2，and tumor-associated trypsin inhibitor in ovarian cancer:prognostic study on tissue and serum［J］.Clin Cancer Res，2004，10(14):4761-4768.

［7］ 罗晓敏，曹建彪.血清胰蛋白酶原-2在大肠肿瘤中的表达及临床意义［J］.解放军医药杂志，2013，25(7):39-41.

［8］ Jin T，Huang W，Jiang K，et al.Urinary trypsinogen-2 for diagnosing acute pancreatitis:a meta-analysis［J］.Hepatobiliary Pancreat Dis Int，2013，12(4):355-362.

［9］ Itkonen O，KylänpääL，Zhang W M，et al.Reference intervals for and validation of recalibrated immunoassays for trypsinogen-1 and trypsinogen-2［J］.Clin Chem，2012，58(10):1494-1496.

［10］ Sainio V，Puolakkainen P，Kemppainen E，et al.Serum trypsinogen-2 in the prediction of outcome in acute necrotizing pancreatitis［J］.Scand J Gastroenterol，1996，31(8):818-824.

［11］Itkonen O.Human trypsinogens in the pancreas and in cancer［J］.Scand JClin Lab Invest，2010，70(2):136-143.

［12］ Largman C，Brodrick J W，Geokas M C，et al.Demonstration of human pancreatic anionic trypsinogen in normal serum by radioimmunoassay［J］.Biochim Biophys Acta，1978，543(4):450-454.

［13］Kimland M，Russick C，Marks WH，et al.Immunoreactive anionic and cationic trypsin in human serum［J］.Clin Chim Acta，1989，184(1):31-46.

［14］姜胜莹，曹建彪，范公忍，等.血清磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3的表达在原发性肝细胞癌中的诊断价值［J］.解放军医药杂志，2013，25(4):18-21.

［15］ Yang X，Miao R，Yang H，et al.A retrospective and comparative study of inflammatory myofibroblastic tumor of the liver［J］.J Gastroenterol Hepatol，2014［Epub ahead of print］.

［16］ Song P，Feng X，Inagaki Y，et al.Clinical utility of simultaneous measurement of alpha-fetoprotein and des-γcarboxy prothrombin for diagnosis of patients with hepatocellular carcinoma in China:A multi-center case-controlled study of 1，153 subjects［J］.Biosci Trends，2014，8(5):266-273.

［17］ Zinkin N T，Grall F，Bhaskar K，et al.Serum proteomics and biomarkers in hepatocellular carcinoma and chronic liver disease［J］.Clin Cancer Res，2008，14(2):470-477.