胃蛋白酶水解红豆蛋白工艺研究

张变玲，张 儒，贺 婷，阳吉平, 景 卓

(湖南工程学院 化学化工学院，湘潭 411104)



胃蛋白酶水解红豆蛋白工艺研究

张变玲，张 儒，贺 婷，阳吉平, 景 卓

(湖南工程学院 化学化工学院，湘潭 411104)

研究胃蛋白酶对红豆蛋白的水解工艺.考察酶浓度、pH、温度、水解时间等因素对红豆蛋白水解度的影响.结果表明：制备的胃蛋白酶能够较好地水解红豆蛋白，其最佳水解工艺为：温度40 ℃、酶浓度7 U/g干蛋白、pH1.5、水解时间4 h，其最佳水解度为30.97%.

胃蛋白酶；红豆蛋白；水解度

0 前 言

蛋白质经消化道酶促水解作用后主要以低肽(特别是二肽和三肽)的形式被直接吸收，低肽的吸收率比氨基酸大，且比完全游离氨基酸更易、更快被机体吸收利用[1-2]；此外，某些低肽不仅能提供人体生长发育所需的营养物质，还具有重要的生理功能，如促进矿物质吸收、防治肝性脑病、促进消化吸收、抑制胆固醇、机体防御、增加脂肪组织代谢等[3].近年来，这些生物活性肽的研究在食品营养学界引起广泛的重视.在植物来源的低肽中，大豆肽的研究比较系统和深入[4]，而且已有几种大豆肽产品得到商品化生产.此外，绿豆肽、花生肽、核桃肽、玉米肽、大米肽和小麦肽等的研究已有报道.而红豆作为我国传统的药食兼用和营养丰富的食物，其蛋白肽的研究甚少.

红豆(Phaseolus angularis)又称赤豆，为菜豆属豆科草本植物赤小豆或赤豆的成熟种子，颜色淡红、鲜红或深红[5].红豆营养价值高，氨基酸种类齐全，口感好，是食品加工业的优质原材料，而且蛋白质含量高，平均达22.65%，比禾谷类蛋白质含量高2～3倍[6].我国传统食用红豆的方式除直接食用外，主要用于加工制成豆沙或者豆馅，再制成各种主副食品，而忽略了对红豆蛋白的开发，造成红豆资源浪费.

胃蛋白酶(pepsin)是一种酸性天冬氨酸蛋白水解酶类，其前体为胃蛋白酶原，在pH1.5～5.0条件下，被活化成胃蛋白酶[7].胃蛋白酶被广泛应用于蛋白质类的水解等[8-10].本文参考文献[11]方法，采用双水相萃取法从猪胃中制备胃蛋白酶，研究各因素对酶水解反应的影响，从而确定猪胃蛋白酶水解红豆蛋白制备红豆蛋白肽的可行性及最佳工艺，既提高了生猪副产物的利用率，又为红豆蛋白肽的研究及新的植物活性肽的开发提供实验依据.因此，研究猪胃蛋白酶水解红豆蛋白工艺有较高的应用价值.

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

红豆，购于步步高湘潭分公司；红豆蛋白粉，自制；猪胃蛋白酶，自制；PEG1000，天津市光复科技发展有限公司；考马斯亮蓝G250、牛血清清蛋白，国药集团化学试剂有限公司；酪氨酸、硫酸铵、盐酸、乙酸、甲醇、乙醇、甲醛、氢氧化钠、酚酞等均为分析纯.

BS323S电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)；UV-2102PCS型紫外-可见分光光度计(尤尼柯上海仪器有限公司)；TDZ5-WS多管架自动平衡离心机(赛特湘仪离心机仪器有限公司)；85-2集热式恒温加热磁力搅拌器(常州澳森电器有限公司)；NH-4数显恒温水浴锅(国华电器有限公司).

1. 2 实验方法

1.2.1 胃蛋白酶的制备及活力测定

[11]方法，选择成年猪胃，剥取猪胃基底部粘膜，液氮迅速冷冻，用研钵磨碎，制成胃粉.以聚乙二醇/硫酸铵双水相萃取分离得到猪胃蛋白酶，并测定其活力.

1.2.2 红豆蛋白粉的制备[12]

红豆→清洗→除杂→研磨→粉碎70目过筛→浸泡→搅拌→调pH值至8～10→离心→上清液→调pH值4.2或5.0→离心→沉淀→干燥→蛋白成品(得率为18.8%)

1.2.3 水解工艺

配制6%的红豆蛋白溶液，在一定温度下保温10 min，达到反应的温度后，调pH至适当值，加入一定量的猪胃蛋白酶进行酶解反应.以1 mol/L NaOH溶液滴定使pH不变，反应一定时间后，取出水解液，立即置于沸水浴中加热10 min，灭活酶以终止酶解反应.酶解液3000 r/min离心15 min，取上清液测定水解度.

1.2.4 红豆蛋白水解度的测定

采用甲醛滴定法测定水解度(DH)[13].

1.2.5 红豆蛋白水解条件优化

1.2.5.1 酶浓度的选择

将红豆蛋白溶液的pH值调至1.5，反应温度为40 ℃，分别在猪胃蛋白酶浓度为0.5、1.5、3.0、5.0、7.0和9.0(U/g干蛋白质)的条件下，水解红豆蛋白3 h，以DH为指标记录实验数据，分析不同加酶量对红豆蛋白水解反应的影响，以初步确定猪胃蛋白酶水解红豆蛋白的合适酶浓度范围.

1.2.5.2 酶解温度的选择

将红豆蛋白溶液的pH值调至1.5，分别置于6个不同的反应温度30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃和60 ℃，按照1.2.5.1实验所测最适酶浓度5.0 U/g干蛋白分别加入胃蛋白酶，水解红豆蛋白3 h，以DH为指标记录实验数据，分析不同温度对红豆蛋白水解反应的影响，以初步确定胃蛋白酶水解红豆蛋白的合适反应温度范围.

1.2.5.3 酶解pH的选择

分别采用1.2.5.1和1.2.5.2测定的最适酶浓度5.0 U/g和最适水解温度40 ℃，在溶液pH值分别为1.0、1.5、2.0、2.5、3.0和3.5的条件下，对红豆蛋白溶液进行酶解反应3 h，以DH为指标记录实验数据，分析不同pH对水解反应的影响，以初步确定胃蛋白酶水解红豆蛋白的合适pH范围.

1.2.5.4 酶解时间的选择

分别采用1.2.5.1、1.2.5.2和1.2.5.3测定的最适酶浓度5.0 U/g、最适水解温度40 ℃和最适反应pH1.5，在水解时间分别为1.0、2.0、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5和7.0 h的条件下对红豆蛋白溶液进行酶解反应，以DH为指标记录实验数据，分析不同水解时间对水解反应的影响，以初步确定胃蛋白酶水解红豆蛋白的合适反应时间范围.

1.2.5.5 正交试验优化酶解工艺

以胃蛋白酶的水解度为指标，根据单因素试验结果确定各因素的水平值范围进行4因素3水平正交试验，按L9(34)正交表安排试验(见表1)，优化酶解条件.

表1 正交实验因素水平表L9(34)

2 结果与分析

2.1 酶浓度对红豆蛋白水解度的影响

酶浓度对红豆蛋白水解度的影响结果见图1，从图中可以看出，当酶浓度从0.5 U/g干蛋白逐渐增大时，蛋白质水解度总体呈现增加趋势，其中酶浓度在0.5～5 U/g干蛋白时，水解度增长趋势较快，酶浓度为5～9 U/g干蛋白时，水解度增加比较缓慢.酶法水解红豆蛋白的过程中适量的酶对酶解具有积极的意义，但酶过量时，酶反应体系中酶使料液的粘度过大，影响了酶和底物的流动，也降低了酶作用效果，同时也增加了成本.但酶量过少时，使酶分子与底物分子碰撞的几率降低，酶作用效果降低.因而酶的使用浓度在3～7 U/g干蛋白范围内效果较好.

图1 胃蛋白酶浓度对水解度的影响

2.2 温度对红豆蛋白水解度的影响

图2 温度对水解度的影响

温度对水解度的影响结果见图2，从图2中可以看出在温度为30～40 ℃之间随温度升高水解度逐渐增大，但是之后随温度增加水解度逐渐降低.温度对酶促反应的影响有两个方面，一般情况下温度提高可使反应速度加快；二是随着温度的提高，酶失活速度也开始加快，因考虑到温度控制，结合本试验结果，胃蛋白酶水解红豆蛋白的最适温度范围40 ℃左右.

2.3 pH对红豆蛋白水解度的影响

pH对红豆蛋白水解度的影响结果见图3，从图中可以看出，随着溶液pH的增加，蛋白质的水解度逐渐增加，当pH为1.5时，蛋白质水解度最高，达29.69%.而后随着pH的增加，蛋白质水解度逐渐降低，蛋白质水解度呈现先升高后降低的趋势.其主要原因是胃蛋白酶属于酸性蛋白酶，分子量为42.2 ku，胃中是以胃蛋白酶原形式存在，在胃酸或已激活的胃蛋白酶的作用下转变为34.1 ku的具有活性的胃蛋白酶[7].在传统的生产工艺中，胃蛋白酶中含有一定量的胃蛋白酶原，因而pH对酶的活性影响甚大，强酸处理使其在体外转化成胃蛋白酶，进而增加其对蛋白质的酶解能力.因此胃蛋白酶水解红豆蛋白的最适pH范围为1.5左右.

图3 pH对水解度的影响

2.4 时间对红豆蛋白水解度的影响

时间对水解度的影响结果见图4，从图中可以看出，随着酶解时间的增加，蛋白质水解度先是显著升高，当水解时间为3.5 h时水解度达到29.06%，之后，随着水解时间的进一步延长，水解度升高趋于平缓.一般来讲，要达到同样的水解率，水解时间与酶的用量有关，酶的用量大，水解时间可以缩短.加酶量相同，时间越长，水解率越高，但达到一定的时间后上升趋势减缓，综合考虑到能耗、生产周期及防止水解液变质等因素.因此，胃蛋白酶水解红豆蛋白的最适水解时间范围为3.5 h左右.

图4 时间对水解度的影响

2.5 胃蛋白酶水解红豆蛋白的最佳工艺确定

根据单因素试验结果，选取适宜因素水平进行4因素3水平正交实验，实验结果见表2.

表2 正交实验结果

对影响胃蛋白酶水解红豆蛋白的4个因素(酶浓度、温度、pH和水解时间)进行极差分析，表明各因素的主次顺序为B>A>C>D，即：温度>酶浓度>pH>水解时间，温度对红豆蛋白的水解程度影响比较显著，极差分析可知4个因素的优选方案为：A3B2C2D3，但是表2中8号实验组合A3B2C1D3的水解度最高，为29.77%，和优选方案组合A3B2C2D3不一致，故对极差分析所得优选方案组合A3B2C2D3和8号实验组合A3B2C1D3进行实验验证，结果8号实验组合水解度为29.71%，极差分析所得优选方案水解度为30.97%，所以最佳实验组合为A3B2C2D3，即酶浓度7 U/g干蛋白、温度40 ℃、pH1.5和水解时间4 h.

3 结 论

采用双水相萃取方法所制备的猪胃蛋白酶能够较好的水解红豆蛋白，在此水解工艺中，影响红豆蛋白水解度的因素主次序为温度>酶浓度>pH>水解时间，其最佳水解工艺为：温度40 ℃、酶浓度7 U/g干蛋白、pH1.5、水解时间4 h，水解度为30.97%.

参 考 文 献

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Preparation Technology of Peptides by Pepsin Hydrolyzation of Proteins Isolated From Red Bean

ZHANG Bian-ling, ZHANG Ru, HE Ting,YANG Ji-ping, JING Zhuo

(College of Chemistry and Chemical Engineering, Hunan Institute of Engineering, Xiangtan 411104, China)

Red bean protein is hydrolyzed by pepsin from stomach of swine. The effects of enzyme concentration, temperature, pH and time on enzymatic hydrolysis are discussed. The results show that the optimal conditions for producing peptides from red bean protein by pepsin are enzyme concentration of 7 U/g dry protein, pH of 1.5, the temperature of 40℃ and hydrolysis time 4.0 h. The degree of hydrolysis is 30.97%.

pepsin; red bean protein; degree of hydrolysis

2014-12-09

湖南省教育厅科研资助项目(11C0329)；国家大学生创新创业训练计划项目(201411342004)；湖南省大学生研究性学习和创新性实验计划项目(湘教通[2014]248号).

张变玲(1982-)，女，硕士，讲师，研究方向：天然活性成分开发与利用.

张 儒(1979-)，男，博士，讲师，研究方向：天然活性成分生物合成调控与开发利用.

R284.2

A

1671-119X(2015)02-0073-04