心房钠尿肽基因敲除小鼠的鉴定

杨 扬，李 斌，叶 杰，亓翠玲，何晓东，李江超，章倩倩，黄 韧，张 钰，王丽京*

(1.广东药学院血管生物学研究所，广东广州 510006；2.广东省实验动物检测所，广东广州 510260)

心房钠尿肽基因敲除小鼠的鉴定

杨 扬1，李 斌1，叶 杰1，亓翠玲1，何晓东1，李江超1，章倩倩1，黄 韧2，张 钰2，王丽京1*

(1.广东药学院血管生物学研究所，广东广州 510006；2.广东省实验动物检测所，广东广州 510260)

研究心房钠尿肽基因敲除小鼠(ANP-/-小鼠)的生物学及病理学特性。ANP-/-小鼠与C57BL/6小鼠饲养于SPF级环境中，观察小鼠的繁育状况及其生物学特性，选取合适时间处死小鼠，通过HE染色观察脏器形态及组织结构。ANP-/-小鼠的繁殖周期比C57BL/6长，产仔率较低；ANP-/-小鼠肝脏、肺脏、脾脏较C57BL/6小鼠的有明显炎症反应，但是C57BL/6小鼠未见明显的病理改变。提示ANP基因的缺失可能与炎症发生有关。说明ANP-/-小鼠繁殖较慢、产仔率低，且正常繁殖的普通小鼠不会引起器官的病理学改变。但作为一种在心血管、代谢疾病上的动物模型，并与炎症甚至肿瘤有可能的未知联系的转基因动物，其很有研究和探索价值。

心房钠尿肽；转基因小鼠；鉴定

钠尿肽( natriuretic peptide, NP) 是近20年发现的一类多肽。国内外研究报道， 到目前为止，人类共发现了5种利钠肽，其中，心房钠尿肽(atrial natriuretic peptide, ANP)是一种由21个～35个氨基酸残基组成的多功能活性肽，又称为心钠素、利钠素、利尿素、血管舒张素[1]。它是一种由心房合成并贮存的活性多肽，通过与心血管、中枢神经系统、生殖器官和肾脏等组织或器官上的钠尿肽受体(natriuretic peptide receptors, NPR) 结合，促进细胞内环磷酸鸟苷的生成[2]。因此，ANP在研究高血压、心功能不全、中枢神经系统疾病及肾功能不全等发病机制和防治上均有重要意义。生理上其具有强大利钠利尿、舒张血管、降低血压、抑制细胞增殖、参与调节免疫及脂质代谢等作用[3]，近年来还发现其在炎症、抗肿瘤方面具有潜在的巨大价值[4-6]。

在本研究所特有的转基因小鼠平台上，我们从美国Jackson实验室引进了ANP基因敲除杂合子(ANP+/-)小鼠并成功进行了繁殖和鉴定[7]，得到ANP基因敲除纯合子(ANP-/-)小鼠并进行配种、观察。同时对其进行组织切片，HE染色后观察其脏器在组织学上是否与同龄普通小鼠存在差异。为进一步研究ANP在疾病和肿瘤发生发展中的作用和相关分子机制提供了更好的动物模型。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 C57BL/6小鼠，2只，雌雄各半，12周龄，为广东省动物中心饲养；ANP-/-小鼠，2只，雌雄各半，12周龄，由繁殖后鉴定纯合子配种所得；引进ANP+/-品系背景为C57BL/6J，雌雄各2只，基因型为杂合子(ANP+/-)。经大半年繁殖和鉴定得到纯合子(ANP-/-)都用于配种(1∶1),实验鼠为其产仔所得。

1.1.2 主要仪器和试剂 PCR仪为美国应用生物系统公司产品；全自动生物组织包埋机、烤片机为PR公司产品、低温离心机为美国热电集团产品；石蜡切片机为德国徕卡仪器公司产品；独立通气笼IVC为苏杭科技器材有限公司产品；其他普通仪器有DYY-C型电泳仪、GENE凝胶成像系统、LG微波炉、台式灭菌器等。

多聚甲醛固定液和genomic DNA裂解缓冲液自己配制；苏木素、伊红染色剂、磷酸盐缓冲液为中杉金桥生物有限公司产品；蛋白酶K、dNTP为Roche 公司产品；Taq酶为康龙生物有限公司产品；琼脂糖粉为Biowest公司产品；PCR引物为英骏生物技术有限公司产品；其他生化试剂：溴化乙锭(EB)、无水乙醇、甲醛溶液、二甲苯、石蜡等均为进口或国产分装试剂。

1.2 方法

1.2.1 基因工程小鼠的饲养和繁殖 ANP+/-小鼠为美国Jackson Laboratory产品(Stock Number: 002685)，品系背景为C57BL/6J，雌雄各2只，基因型为杂合子(ANP+/-)。经半年繁殖和鉴定得到纯合子(ANP-/-)共8只都用于配种(1∶1)和观察。

小鼠均饲养于SPF级环境中。饲养室内的温度保持在22 ℃～28 ℃，相对湿度维持在40%～60%，噪音<60 dB，日夜温差为2 ℃，昼夜明暗交替时间12 h/12 h。饲料为广东省医学实验动物中心产品，小鼠饮用水、笼盒和垫料均经高温高压灭菌处理。小鼠的繁殖选择将性成熟(6周龄～8周龄)纯合子1∶1同笼配种，对配种小鼠定期给予蛋黄或灭菌葵花籽以补充营养。每天密切观察小鼠饮食、活动及全身情况。及时记录小鼠受孕及分娩时间。

1.2.2 基因工程小鼠的鉴定与筛选 待哺乳期满(18 d～21 d)且经过分笼后的小鼠即可进行DNA鉴定。由于引进的ANP小鼠为杂合子(ANP+/-)，根据孟德尔定律其子代可能为3型：ANP+/+、ANP+/-、ANP-/-，故需要鉴定得到待研究对象。

1.2.2.1 小鼠组织DNA提取 用消毒后的剪刀剪下小鼠尾尖部约1 cm置于1.5 mL EP管中，参照上海捷瑞生物工程有限公司组织/细胞DNA提取试剂盒说明提取小鼠DNA加无菌去离子水后于4 ℃保存待用。

1.2.2.2 PCR基因扩增 引物序列分别为：5′-CCTTCTATCGCCTTCTTGACG-3′；5′-CTGTCCAACACAGATCTGATG-3′；5′-CTGTTGCAGCCTAGTCCACT-3′；PCR反应条件为：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，61 ℃ 1 min ，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 2 min 。

1.2.2.3 琼脂糖凝胶电泳与基因型鉴定 取PCR反应产物7 mL，加入10× loading buffer 1 mL, 加样于15 g/L琼脂糖凝胶孔，于TAE电泳缓冲液中电泳(170 V，20 min)。用Gene公司凝胶成像系统观察电泳结果。

1.2.3 制作主要脏器组织石蜡切片并HE染色 脱颈椎法处死小鼠, 并进行详细解剖和检查。对主要脏器取材, 经多聚甲醛固定液液固定12 h，石蜡包埋、切片7 mm厚度，HE染色，中性树胶封片后显微镜下观察并拍照分析。

2 结果

2.1 ANP-/-小鼠基因型鉴定

亲代ANP小鼠均为杂合子(ANP+/-)配种，故子代小鼠有杂合型(ANP+/-)、纯合型(ANP-/-)和野生型(ANP+/+)3种基因型。出现在700 bp条带是纯合子(ANP-/-)小鼠，出现在434 bp条带是野生型(ANP+/+)小鼠。同时出现以上2条带电泳带为杂合子(ANP+/-)小鼠。可见1号～5号和10号小鼠电泳条带位于700 bp和434 bp处，为杂合子；6号～8号小鼠电泳条带位于700 bp处，为纯合子；9号位于434 bp处，为野生型(图1)。

图1 ANP-/-小鼠基因型鉴定结果Fig.1 Genotype identification results of mouse ANP-/- gene

2.2 ANP-/-小鼠生殖情况统计

对繁殖鉴定所得ANP-/-小鼠进行配种，持续观察其生长状态并记录其生殖率。自2012年11月至今，共用8笼ANP-/-纯合子1∶1配种，统计其繁殖周期及产仔率后与同期本所动物房内配种C57BL/6小鼠繁殖周期及产仔率进行对比，发现ANP-/-小鼠的繁殖周期(图2A)平均比C57BL/6小鼠长10 d左右，且每胎产仔率(图2B)大都1只～4只，明显低于C57BL/6小鼠，且有统计学意义(P<0.05)。因此我们判断，ANP基因敲除小鼠的繁殖周期较C57BL/6略长，产仔率较C57BL/6较低。

图2 ANP-/-小鼠的繁殖周期与产仔数与C57小鼠统计对比Fig.2 The comparison of reproductive cycle and litter size between ANP-/- mice and C57BL/6 mice

2.3 ANP-/-小鼠主要脏器对正常小鼠C57BL/6组织病理学观察对比

分别各取2只12周龄ANP-/-小鼠与C57BL/6小鼠，雌雄各半，同时处死后石蜡包埋脏器，HE染色对比其组织结构。肉眼观察无论雌雄ANP-/-小鼠的主要脏器相对C57BL/6小鼠未见明显严重改变。其HE切片在低倍(200×)观察发现，心肌细胞形态未见明显改变(图3A和图3C)；肾小体结构无明显异常，但在试验组及对照组肾小管上皮内均可见少量颗粒变性，可能因为饲养环境及应激反应致肾小球滤过性状改变，导致管腔内产生少量蛋白质、细胞或者细胞碎片管型所致(图3B和图3D)。心脏及肾脏细胞核亦未见异常分裂相。

图3 ANP-/-小鼠和C57BL/6小鼠心肌和肾脏组织结构对比图(200×)Fig.3 Histological observation of myocardia and renal structures in ANP-/- mice and C57BL/6 mice

但在ANP-/-小鼠肝脏、脾脏、肺脏中低倍视野即可见较明显病理性改变。对有轻微病理性改变的脾脏、肝脏、肺脏进行高倍(400×及1 000×)观察，我们发现ANP基因缺失小鼠的脾脏红髓白髓边界模糊不清，淋巴细胞核深染且增生明显并有炎性细胞浸润(箭头所指)；肝脏组织内肝板结构不清，部分肝细胞存在水肿及轻微脂肪变性，且有小部分炎性细胞聚集(箭头所指)；肺脏切片也看到部分肺泡壁明显增厚、炎性细胞浸润(箭头所指)。提示ANP缺失可能与炎症发生发展有关(图4)。

3 讨论

自1955年Kisch等发现心房细胞内含有特殊的分泌颗粒，到1984年Debold等从大鼠以及人心房组织中分离、提纯了到心钠素，并证明它是一种由28个氨基酸组成的肽，称为心房钠尿肽 (atrial natriuretic poly peptide，ANP)，又称心钠素 ( cardionatin ) 。ANP开始正式进入越来越多科学家的研究领域，后逐渐发现其具有强大的排钠利尿、扩张血管和降血压的作用，ANP及其类似结构蛋白也逐渐有了更多临床开发前景。因为ANP同时具有增加血管通透性, 并抑制肾素-血管紧张素-醛固酮系统,还对体内的水电解质平衡，心血管活动及内分泌的调节起着重要作用，它在心血管以及代谢疾病中也逐渐呈现出越来越重要的角色[8]。同时ANP的受体NPRA被发现在越来越多的肿瘤组织中高表达，包括肺癌、卵巢癌、黑色素瘤等[9]，提示ANP可能跟肿瘤的发生发展有一定关系。因此，关于ANP动物模型的需求也随之而生并越来越大。

图4 ANP-/-小鼠部分炎细胞增生脏器与C57BL/6小鼠对比图Fig.4 Histological observation of C57BL/6 mice and ANP-/- mice which organs with inflammation

1995年北卡来罗纳大学的Dr. Oliver Smithies率先成功构建ANP基因敲除(ANP-/-)小鼠，主要用于研究心血管疾病和食源性高血压。该小鼠属于盐敏感性高血压小鼠，即杂合子在低盐饮食时血压无明显异常，高盐饮食是呈现高血压，而纯合子在无论高盐还是低盐都呈现高血压。目前,已用ANP-/-小鼠的研究主要集中在2个方面，即心血管疾病、代谢疾病。而最近研究发现，ANP可能具有抗肿瘤血管生成及促进肿瘤细胞凋亡的作用，它还可缓解抗癌药物对肾脏肝脏的毒性作用，这种心脏激素可单独或联合应用于多种肿瘤的治疗[10]。但这些研究大都集中在细胞试验，多缺乏体外动物试验及组织学等佐证。而常见的实验动物造模方式[11]在此类分泌蛋白课题上无法进行，且ANP蛋白价格昂贵，故研究探索ANP-/-小鼠的生物学特性和病理特征，对以后开展更多的动物试验有重要意义。

而我们通过对繁育所得ANP-/-小鼠的生物学和病理观察，发现其繁殖周期及产仔率都较明显低于正常小鼠，这可能与母鼠孕期血压或者子宫血管病变有关。同时还发现ANP-/-小鼠主要脏器存在不同程度炎性细胞浸润，提示我们ANP的缺失可能与炎症的发生与发展有一定关联性。这也为以后对ANP与炎症、肿瘤等研究提供了很好的指路作用。总之，对转基因实验动物模型的生物学特征和病理观察[12],对于以后探索基因与疾病关系和新药开发是至关重要的。

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Identification of Atrial Natriuretic Peptide Gene Knockout(ANP-/-)Mice

YANG Yang1,LI Bin1,YE Jie1,QI Cui-ling1,HE Xiao-dong1,LI Jiang-chao1,ZHANG Qian-qian1,HUANG Ren2,ZHANG Yu2,WANG Li-jing1

(1.InstituteofVascularBiology,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou,Guangdong,510006,China；2.GuangdongLaboratoryAnimalMonitoringInstitute,Guangzhou,Guangdong,510260,China)

To investigate the biological features of new transgenic mice (ANP-/-mice) and compare its pathological features with normal mice. ANP-/-mice and C57BL/6 mice (normal control mice) were housed in the same SPF environment to observe the multiplication and study their biological characteristics. The histological morphology and structure of organs were compared with normal mice. The ANP-/-mice have longer reproductive cycle and lower birth rate; Moreover, ANP-/-mice show slightly higher inflammatory response than C57BL/6 mice, suggesting that ANP gene may associated with inflammation. The reproduction and birth rate of ANP-/-mice are slow, but as the animal model used in cardiovascular and metabolic disease, even inflammation or cancer, they have potential research and exploration value.

atrial natriuretic peptide;transgenic animal model;identification

2014-05-11

国家自然科学基金项目(31271455)

杨 扬(1988-)，女，陕西杨凌人，硕士研究生，主要从事转基因动物分子病理学研究。*

R737.9; R965.1

:A

:1007-5038(2015)01-0071-04