鸡传染性鼻炎(三价)和新城疫二联灭活疫苗的研究

龚玉梅，张培君*，朱文革，贺云霞，王宏俊，张 瑜， 邵庆红

(1.北京市农林科学院畜牧兽医研究所，北京 100097；2.北京信得威特科技有限公司，北京顺义 101302)

鸡传染性鼻炎(三价)和新城疫二联灭活疫苗的研究

龚玉梅1，张培君1*，朱文革2，贺云霞1，王宏俊1，张 瑜2， 邵庆红2

(1.北京市农林科学院畜牧兽医研究所，北京 100097；2.北京信得威特科技有限公司，北京顺义 101302)

利用Page A型、B型、C型副鸡禽杆菌和新城疫病毒La Sota株，研制鸡传染性鼻炎(三价)和新城疫二联油乳剂灭活疫苗。用3个批次疫苗进行单剂量(0.5 mL/次)3次接种和大剂量(2.0 mL)单次接种的安全性试验、SPF鸡的免疫效力试验、商品鸡的免疫持续期试验和疫苗的保存期试验。结果表明，3批疫苗对试验鸡安全无副作用；免疫接种SPF鸡只30 d后对A、B、C型副鸡禽杆菌攻毒的保护率≥80%,用20 μL/只疫苗免疫接种SPF鸡21 d后新城疫的平均HI抗体>24；商品鸡42日龄首免，110日龄二免，二免后9个月对A、B、C型副鸡禽杆菌攻毒的保护率≥70%，对新城疫病毒强毒100%保护；用4 ℃～8 ℃保存12个月和15个月的3批疫苗进行了SPF鸡的近期免疫效力试验，结果对A、B、C型副鸡禽杆菌攻毒的保护率≥70%，用20 μL/只疫苗免疫SPF鸡，免疫接种后21 d新城疫病毒的平均HI抗体>24，对新城疫病毒强毒的攻毒保护率>70%。说明研制的疫苗安全有效。

鸡传染性鼻炎;新城疫;三价;二联;灭活疫苗

鸡传染性鼻炎(Infectious coryza，IC)是由副鸡禽杆菌(Avibacteriumparagallinarum，Avpg)引起的上呼吸道传染病[1-2]，副鸡禽杆菌在2005年以前称为副鸡嗜血杆菌(Haemophilusparagallinarum，Hpg)，主要影响蛋鸡的产蛋和肉鸡的肉质[2]。本病世界各国均有发生，给养鸡业造成较大经济损失[2]。美国加利福尼亚一个蛋鸡场暴发鸡传染性鼻炎，没有检测到其他病原体的混合感染，导致病死率升高至48%，并且在3个星期之内产蛋率从75%下降至15.7%[2]。按照Page的分型方案，副鸡禽杆菌可以分为A、B和C 3个血清型，血清型之间不产生交叉保护[2]。1986年以来，我国已先后报道了A、B和C 3个血清型副鸡禽杆菌所致的鸡传染性鼻炎[3-12]。2012年12月，北京、安徽和山东等地又较大规模暴发鸡传染性鼻炎，其病原经细菌分离鉴定为B型副鸡禽杆菌[11-12]。鸡新城疫是可以导致鸡只高发病率和高病死率的病毒性疫病[2]。鸡传染性鼻炎有时与新城疫混合感染，使病情加重，死淘率增加。

为有效防控鸡传染性鼻炎和新城疫，减少兽医人员的劳动强度，参考本实验室鸡传染性鼻炎(A+C型)-新城疫二联油佐剂灭活疫苗、鸡传染性鼻炎三价(A+B+C型)油乳剂灭活疫苗的研究方法和制作工艺，研制了3批鸡传染性鼻炎三价和新城疫

二联灭活疫苗，现将这3个批次疫苗的安全性试验、效力检验、保存期试验和免疫持续期试验报道如下[13-17]。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和毒株 副鸡禽杆菌 B型菌为北京株由由本实验室分离鉴定；A型菌为C-Apg-8(CVCC254株)、C型菌为Apg-668株购自中国兽医药品监察所，3个菌株均保存在北京市农林科学院畜牧兽医研究所；新城疫病毒La Sota株(CVCC AV1615)、鸡新城疫病毒北京株(CVCC AV1611)购自中国兽医药品监察所，保存在北京信得威特科技有限公司。

1.1.2 培养基 鸡血清鸡肉汤、鸡血清鸡肉汤琼脂、半合成培养基等，均参照冯文达等的配方[15-16]，并添加适量的辅酶Ⅰ(NADH)。

1.1.3 试验用动物 SPF种蛋、21日龄、28日龄和42日龄SPF鸡为北京梅里亚维通实验动物技术有限公司产品。

1.1.4 试剂 司本-80、吐温-80为上海申宇医药化工有限公司产品；硬脂酸铝为上海远航试剂厂产品；白油(Marcol-52)为法国SEPPIC 公司产品。

1.1.5 浓缩机 圣万泉移动式超滤浓缩机(膜包型)10万分子量。

1.2 方法

1.2.1 抗原制备

1.2.1.1 副鸡禽杆菌抗原 ①一级种子培养。将上述3个菌株分别接种鸡血清鸡肉汤琼脂平皿，在37 ℃、体积分数为5% CO2条件下培养16 h～18 h，挑取典型菌落分别接种半合成培养基，37 ℃培养16 h～24 h，纯检和无菌检验，保存于-80 ℃备用；②制苗用抗原。将纯检和无菌检验合格的3个血清型一级种子，按照3%比例分别接种半合成培养基，37 ℃培养16 h～24 h，纯检和无菌检验，加入2.5 mL/L的福尔马林灭活，纯检和无菌检验合格的菌液离心至所需浓度置4 ℃备用。

1.2.1.2 新城疫病毒抗原制备 将La Sota种毒做适当稀释后接种10 d～11 d SPF鸡胚，继续孵化96 h～120 h，无菌收获尿囊液，取HA价≥640的尿囊液用超滤浓缩机作2倍浓缩，加入2.5 mL/L的福尔马林灭活备用。

1.2.2 制苗 将2倍浓缩的NDV和所需浓度的副鸡禽杆菌抗原(含3个血清型)按照2∶3混合，再与油乳剂按照1∶1制备成疫苗，此疫苗含A型菌6.0×108CFU/mL，B型菌1.0×109CFU/mL，C型菌8.0×108CFU/mL。按照此方法制备三批疫苗，其批号为201101、201102和201103。

1.2.3 安全性试验 21日龄SPF鸡70只，饲养在SPF鸡隔离器内，随机等量分成7组，第1组～第3组为大剂量注射组，分别注射上述3批疫苗，每只鸡注射疫苗2.0 mL；第4组～第6组为单剂量3次注射组，分别注射上述3批疫苗，每只鸡注射0.5 mL，3 d后进行第2次注射，再3 d后进行第3次注射；第7组为非接种对照组。所有鸡只于第4组～第6组第3次注射后再观察14 d。观察接种鸡的饮水、采食和排粪等情况。大剂量注射组和单剂量3次注射组各取1组鸡只与非免疫对照组一道每2 d称重1次[15-17]。

1.2.4 效力试验

1.2.4.1 鸡传染性鼻炎部分 将42日龄SPF鸡120只随机分成4组，3个免疫组用上述3批疫苗免疫，每只鸡胸部肌肉注射0.5 mL，第4组为非免疫对照，同条件饲养。免疫后30 d每组取10只鸡用A、B、C型副鸡禽杆菌攻毒，攻毒后观察7 d[15-17]。

1.2.4.2 鸡新城疫部分 35只28日龄SPF鸡，上述3批疫苗每批疫苗各胸部肌肉随机注射10只鸡，每只鸡20 μL，另5只作非免疫对照。接种21 d后，每只鸡分别采血分离血清，进行HI抗体效价测定，所有鸡只各肌肉注射鸡新城疫病毒强毒北京株(CVCC AV1611)0.5 mL(含105.0ELD50)，观察14 d[18]。

1.2.5 免疫持续期 280只42日龄商品罗曼蛋鸡为大兴区种鸡场产品，无鸡传染性鼻炎病史，简称试验鸡，其中260只随机分成4组，用前述3批疫苗各免疫65只鸡，每只鸡胸部肌肉接种疫苗0.5 mL。第4组接种禽流感(H9亚型)-新城疫二联灭活疫苗(由本所姜北宇研究员惠赠)，每只鸡胸部肌肉接种疫苗0.5 mL。另外20只相同日龄的鸡只留作新城疫非免疫对照。第1次免疫后68 d(108日龄)每组随机抽样10只鸡，加新城疫非免疫对照鸡，采血测定新城疫HI效价；同时第1组～第3组195只鸡用上述3批疫苗进行第2次免疫，每只鸡胸部肌肉接种疫苗0.5 mL，第4组65只鸡接种禽流感(H9亚型)-新城疫二联灭活疫苗，每只鸡胸部肌肉接种疫苗0.5 mL。第2次免疫后3、6、9个月，每组随机抽样10只鸡，加新城疫非免疫对照鸡，采血测定新城疫HI效价。二免后6个和9个月，4个免疫组每组随机抽取30只鸡用A、B、C型副鸡禽杆菌攻毒[15-17]，观察7 d；观察结束的当日，4个免疫组各随机取10只鸡，新城疫非免疫对照组取5只鸡，各肌肉注射鸡新城疫病毒强毒北京株(CVCC AV1611)0.5 mL(含105.0ELD50)，攻毒后观察14 d[18]。

1.2.6 疫苗保存期试验 上述3批疫苗保存在4 ℃～8 ℃，保存12个和15个月时，按照1.2.4.1和1.2.4.2进行鸡传染性鼻炎和新城疫病毒的效力检验[15-17]。

2 结果

2.1 安全性试验

所有70只鸡在试验结束时均健康存活。详细结果见表1和表2。日增重试验(共计12 d)，3组鸡只的日平均增重为：大剂量免疫组14 g，单剂量3次免疫组12.4 g，非免疫对照组14.55 g。尽管单剂量3次注射组平均日增重比非免疫对照组少2.15 g，但统计结果表明,3组日增重差异不显著(P>0.05)。

表1 大剂量接种组Table 1 High dose inoculated groups

表2 单剂量3次接种组Table 2 Single dose inoculation for 3 times groups

2.2 效力试验

2.2.1 鸡传染性鼻炎部分 免疫后30 d，4组鸡只每组分别取10只攻击A、B、C型副鸡禽杆菌，攻毒剂量为A型5.0×105CFU/0.2 mL/只鸡，B型2.0×105CFU/0.2 mL/只鸡，C型5.0×105CFU/0.2 mL/只鸡，攻毒部位为眶下窦内注射。攻毒后观察7 d，观察鸡只的精神状态、饮水和采食情况等[9-11]。详细结果见表3。

表3 IC(三价)-ND二联灭活疫苗SPF鸡近期效力试验Table 3 The potence test of IC-ND vaccine in SPF chickens

2.2.2 新城疫部分 3批疫苗免疫鸡只(20 μL/只)的ND HI平均效价分别为5.5、4.1、4.2、5只非免疫对照鸡只的ND HI平均效价为0.6；对ND强毒的攻毒保护率分别为10/10、8/10、9/10，非免疫对照组为0/5。

2.3 试验鸡(罗曼蛋鸡)二免持续期试验

2.3.1 ND的HI效价 二免的当天，二免后90、180、270 d，各组随机采集的10只鸡血清，按照国标16550-1996新城疫检验技术规范测定HI效价(表4)。

表4 二免当天和二免后90、180、270 d NDV HI效价Table 4 HI Titers of NDV at 0, 90, 180 and 270 days for second vaccination

2.3.2 试验鸡(罗曼蛋鸡)二免后180 d和270 d攻毒结果 第2次免疫接种后180 d和270 d，每个试验组随机取30只鸡用副鸡禽杆菌进行攻毒试验，攻毒剂量为A型5.0×105CFU/0.2 mL/只鸡，B型2.0×105CFU/0.2 mL/只鸡，C型5.0×105CFU/0.2 mL/只鸡，攻毒部位为眶下窦内注射。攻毒后观察7 d，观察鸡只的精神状态、饮水和采食情况等[9-11]。副鸡禽杆菌攻毒观察结束的当天，每组随机取10只鸡+ND非免疫对照组5只鸡，用新城疫病毒北京株(CVCC1611)攻毒，剂量为每只鸡肌肉注射0.5 mL(含105.0ELD50) (表5和表6)[12]。

表5 试验鸡二免后180 d攻毒结果Table 5 Challenged test results 180 days after second immunized in conventional chickens

表6 试验鸡二免后270 d攻毒结果Table 6 Challenged test results 270 days after second immunized in conventional chickens

2.4 疫苗保存期试验

2.4.1 疫苗保存12个月的试验结果 4 ℃～8 ℃保存12个月的3批疫苗，免疫42日龄SPF鸡只30 d后攻击A、B、C型副鸡禽杆菌，攻毒剂量同2.2.1，其攻毒结果见表7；免疫4周龄SPF鸡只(20 μL/只)，21 d后测定ND的HI平均效价分别为5.0、4.9、5.0，非免疫对照鸡为1.2；对NDV强毒的攻毒保护率分别为9/10、9/10、10/10，非免疫对照为0/5(表7)。

2.4.2 疫苗保存15个月的试验结果 4 ℃～8 ℃保存15个月的3批疫苗，免疫42日龄SPF鸡只30 d后攻击A、B、C型副鸡禽杆菌，攻毒剂量同2.2.1，其攻毒结果见表8；免疫4周龄SPF鸡只(20 μL/只)，21 d后测定ND的HI平均效价分别为5.6、5.2、5.3，非免疫对照鸡为1.0；对NDV强毒的攻毒保护率分别为10/10、10/10、10/10，非免疫对照为0/5(表8)。

表7 疫苗保存期试验ⅠTable 7 The storage duration test Ⅰ of the vaccines

表8 疫苗保存期试验ⅡTable 8 The storage duration test Ⅱ of the vaccines

3 讨论

本试验按照农业部442号公告有关要求进行了安全性试验，三批疫苗(201101，201102，201103)无论是大剂量接种还是单剂量3次接种，对鸡只没有副反应，试验结束时，所有鸡只均健活，大剂量接种、单剂量3次重复接种和非免疫3组鸡只的平均日增重差异不显著(P>0.05)，表明鸡传染性鼻炎(三价)-新城疫二联油乳剂灭活疫苗安全性良好。

IC效力试验结果表明，201101、201102和201103三批二联灭活疫苗免疫SPF鸡只30日时攻击A、B、C型副鸡禽杆菌，其保护率均≥8/10，总保护率为87/90(表3)；4 ℃～8 ℃保存12个月的3批疫苗免疫SPF鸡只，对A、B、C型副鸡禽杆菌的攻毒保护率均≥7/10，总保护率为74/90(表7)；4℃～8℃保存15个月的三批疫苗免疫SPF鸡只，对A、B、C型副鸡禽杆菌的攻毒保护率均≥7/10，总保护率为78/90(表8)。

ND效力试验结果表明，201101、20102和201103三批二联灭活疫苗免疫SPF鸡只，每只鸡接种20 μL，其HI抗体平均值均>24，对新城疫强毒的攻毒保护率均>7/10；4 ℃～8 ℃保存12个月和15个月免疫SPF鸡只，其ND HI抗体均值均>24，对新城疫强毒的攻毒保护率均>7/10。ND效检结果符合《中国兽药典》2010年版新城疫单苗的效检标准。

试验鸡的免疫持续期试验结果表明，在42日龄首免，108日龄二免，二免后3、6、9个月的ND HI抗体为26.9～28.1(表4)；二免后6个月和9个月对新城疫强毒的攻毒保护率为100%，对A、B、C型副鸡禽杆菌的攻毒保护率均≥7/10，总保护率分别为70/90和68/90(表5和表6)。

鉴于试验鸡只仅养殖在相对隔离的小环境，免疫持续期试验时间长达12个月，存在自然感染NDV野毒的风险，为了不影响副鸡禽杆菌攻毒鸡的数量，又要兼顾NDV强毒攻毒时有非免疫对照鸡，故我们仅设了20只鸡为ND非免疫对照鸡，用65只鸡免疫鸡新城疫+禽流感(H9)二联灭活疫苗作为副鸡禽杆菌攻毒非免疫对照组。

试验结果表明，我们研制的IC(三价)和新城疫二联灭活疫苗安全性和免疫原性良好。4℃～8℃保存，其保存期为15个月。42日龄首免，110日龄左右(开产前)二免，二免持续期为9个月。达到了接种一种疫苗有效预防鸡传染性鼻炎和新城疫两种重要疫病的目的。

国外公司早期多研制鸡传染性鼻炎氢氧化铝胶灭活疫苗[17]，我们曾经用进口的鸡传染性鼻炎氢氧化铝胶灭活疫苗和我们自己研发的油乳剂灭活疫苗进行比较试验，结果对副鸡禽杆菌的攻毒保护率油乳剂苗优于铝胶苗，这可能与油乳剂的非特异性免疫能力较强有关(张培君等未发表资料)。

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Studies on Combined Infectious Coryza (Serotype A + Serotype B + Serotype C) and Newcastle Disease Inactivated Vaccine

GONG Yu-mei1,ZHANG Pei-jun1,ZHU Wen-ge2,HE Yun-xia1,WANG Hong-jun1,ZHANG Yu2,SHAO Qing-hong2

(1.InstituteforAnimalHusbandryandVeterinaryScience,BeijingAcademyofAgriculturalandForestryScience,Beijing,100097,China; 2.BeijingSinderVet-technologyCO.,LTD.Shunyi,Beijing,101302,China)

Using Page's serovar A, B and C ofAvibacteriumparagallinarum(Avpg) and LaSota strain of NDV developed a combined infectious coryza and newcastle disease inactivated vaccines. Three batch of vaccines used for safety test.The chickens were injected 0.5 mL/chicken at a time for three times and 2.0 mL/chicken at a time. Efficacy tests were carried out on three batches of vaccines using SPF chickens, 30 days after immunization, the chickens were challenged with Page's serovar A, B and C of Avpg. The immune duration test of the conventional chickens which were immunized at 42 days old and 110 days old. Nine months after second immunization, the chickens were challenged with Page's A, B, C of Avpg and virulent Newcastle disease virus. The effect of storage on the vaccines was evaluated in SPF chickens using three batches of vaccineS stored at 4 ℃-8 ℃ for 12 and 15 months. The result showed that the vaccines is very safe, and challenged protection rate of immunized SPF chickens is ≥ 80% for Page's serovar A, B and C of Avpg. HI titer of ND is great than 24for immunized SPF chickens using 20 μL vaccine. The conventional chickens were challenged at 9 months post second vaccination and the protection rate ≥ 70% for all three serovars, and 100% against the virulent Newcastle disease virus. The protection rate of immunized chickens using the vaccines stored at 4 ℃-8℃ for 12 and 15 months is ≥70% for Page's serovar A, B and C of Avpg, HI titer is great than 24and 7/10 against the virulent Newcastle disease virus. The developed vaccine is safe and effective.

Infectious coryza;Newcastle disease;Avibacteriumparagallinarum;trivalence vaccine;inactivited vaccine

2014-05-06

公益性行业(农业)科研专项经费项目(201303044)；北京市财政专项资助项目(KJCX201104002)

龚玉梅(1961-)，女，湖南华容人，高级兽医师，主要从事动物疫病诊断与预防工作。*

S858.31

:A

:1007-5038(2015)01-0040-05