乳腺癌组织中Maspin、Bmi-1的联合表达及临床病理学意义

陈淑苹 车爱文 谭旭东 李家梁 孔继光

乳腺癌的发生、发展是一个多因素、多基因参与的错综复杂的过程，在其进展过程中会出现多基因和蛋白表达的异常，其中癌基因的激活和抑癌基因的失活是细胞癌变的分子基础。Maspin和Bmi-1是近年发现的抑癌基因和原癌基因。Maspin是一种肿瘤抑制基因，抑制多种肿瘤细胞活性，且在肿瘤细胞的运动、侵袭以及新生肿瘤性血管形成多环节中均发挥着重要的作用;Bmi-1基因是一种原癌基因，属多梳基因家族成员，参与细胞增殖和肿瘤发生的调控，是与细胞周期和增殖相关的重要转录抑制子。目前多项研究报道Bmi-1在多种肿瘤中高表达，并且与肿瘤的转移和扩散相关［1］。本实验通过免疫组织化学SP法联合检测Maspin和Bmi-1的在乳腺癌组织中的表达情况及临床生物学指标，旨在探讨两者在乳腺癌发生、发展中的作用及其临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 以我院2010年1月至2014年11月外科手术切除的乳腺标本作为研究对象。通过查阅病例选取浸润癌60例，正常乳腺组织35例，均为女性，年龄25～69岁，中位年龄48岁;患者术前均无放疗、化疗和内分泌治疗。所有标本经10%中性甲醛固定，石蜡包埋4 μm厚切片。

1.2 免疫组织化学染色 应用免疫组化技术检测标本中Maspin和Bmi-1的表达。鼠抗人Maspin单克隆抗体为美国Neomaker公司的产品，鼠抗人Bmi-l单克隆抗体购自美国Upstate公司，SP免疫组化试剂盒购自北京中杉金桥生物技术公司。免疫组化染色采用S-P法，严格按说明书步骤进行实验。以试剂公司提供的阳性对照片作为阳性对照，以磷酸盐缓冲液代替一抗作为阴性对照。Maspin以胞质和(或)胞核内出现棕黄色细颗粒为阳性细胞，Bmi-l蛋白阳性表达以细胞核内呈现棕黄色或者棕褐色颗粒为主，少量胞浆内也有棕黄色颗粒;采用半定量积分法，将染色强度分为3级:无着色1分，浅着色2分，棕黄色3分;按阳性瘤细胞的百分比分3级:≤25%为Ⅰ级记1分，26%～75%为Ⅱ级记2分，≥76%为Ⅲ级记3分。每张切片最后的得分为两次评分的乘积(1～9分)。≥3分为阳性，＜3分为阴性。

1.3 统计学分析 应用SPSS 15.0统计软件，各组间样本率差异的比较采用χ2检验，两资料之间的相关性采用Spearman等级相关分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Maspin和Bmi-1在乳腺组织中的表达 Maspin在正常乳腺组织主要表达于胞浆内，胞核与胞膜上少有表达，阳性表达率为94.29%，在乳腺癌组织中表达不强，阳性率降低为45%。Bmi-1阳性表达主要集中在胞核中，高倍镜下呈棕黄色颗粒，在乳腺癌中阳性表达率为76.7%，高于正常乳腺组织中的阳性表达率(28.57%)，两项指标在乳腺癌和正常乳腺组织中的表达的差异均有统计学意义(P＜0.05)。见图1、2，表1。

2.2 Maspin和Bmi-1表达与乳腺癌临床病理特征的关系 Maspin、Bmi-1阳性表达均与年龄和肿瘤大小无显著差异(P＞0.05);Maspin阳性与肿瘤分化差异不大(P＞0.05)，随分化增加Bmi-1阳性表达有明显差异(P＜0.05)，TNM分期越高，Maspin阳性表达越低，Bmi-1阳性表达越高(P＜0.05);伴腋窝淋巴结转移者Maspin阳性表达显著降低，Bmi-1阳性表达显著上升，Maspin、Bmi-1阳性表达差异有统计学意义(P＜0.05)。见表2。

图1 Maspin在乳腺癌中的表达(SP×400)

图2 Bmi-1在乳腺癌中的核表达(SP×400)

表1 Maspin和Bmi-1在乳腺癌及正常乳腺组织中的表达比较例(%)

表2 Maspin和Bmi-1蛋白的表达与乳腺癌临床病理特征的关系例(%)

2.3 Maspin和Bmi-1表达的相关性分析 经Spearman等级相关分析显示，乳腺癌组织中Maspin蛋白表达与Bmi-1表达呈负相关(r=-0.78，P＜0.05)。见表3。

表3 Maspin和Bmi-1表达水平之间的关系 例

3 讨论

Maspin基因是一种抑癌基因，是1994年Zou等［2］用减数杂交技术发现的，属于丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族成员，研究证实，Maspin存在于正常的口腔黏膜、乳腺、胃肠道等黏膜中，高水平表达，而在相应的恶性肿瘤中，其含量明显下降［3］，随着肿瘤的侵袭和转移，表达逐渐消失。Maspin基因可作用于纤维母细胞生长因子和血管内皮生长因子，阻断细胞的有丝分裂和管道的形成［4］，诱导内皮细胞凋亡，Maspin能直接抑制培养基中的血管内皮细胞向血管内皮生长因子和碱性纤维生长因子转化，进而抑制有丝分裂和肿瘤血管的生成［5］;Maspin还可以增加细胞与细胞外基质的黏附，减低细胞的运动能力［6］;当Maspin表达下调或发生基因沉默时［7］，导致上述综合作用明显减弱。从而促进肿瘤的发生，进展。另有结果显示用质粒或反转录病毒转染乳腺肿瘤细胞使其Maspin表达上调后，肿瘤的生长和转移被明显抑制［8］。且Maspin阳性的肿瘤细胞其穿过基底膜的能力明显低于Maspin阴性表达的肿瘤细胞。故Maspin在肿瘤生长、运动、转移及肿瘤血管生成过程中发挥着重要的作用。本实验结果显示Maspin在正常乳腺组织中高表达，阳性率为94.29%，而在乳腺癌组织中低表达，阳性率为45%，差异有统计学意义(P＜0.05)，提示Maspin的低表达可能是导致乳腺癌发生的原因之一，结果还显示Maspin的表达与临床分期及淋巴结转移相关，提示Maspin的低表达与乳腺癌的进展和恶化相关，与研究结果相一致。在乳腺癌的发生、演变过程中起重要作用，并与患者的生存期密切相关，可作为预测乳腺癌预后的参考指标。

Bmi-1基因是多梳基因家族中成员之一，是一种广泛表达的核蛋白，作为一种原癌基因，调节HOX基因的转录［9］，参与细胞增殖和肿瘤发生的调控。高表达Bmi-1的细胞被认为是肿瘤中存在的“癌症干细胞”。其作用机制可能为:Bmi-1蛋白进入细胞核与染色质结合，通过抑制其下游INK4a，来抑制 cyclinDCDK4从而诱导细胞从Gl期进入S期，促进肿瘤增殖，同时增加MDM-2的活性，减少细胞的凋亡［10］。另外，还可与c-myc基因协同作于肿瘤细胞，使其逃逸凋亡［11］;激活肿瘤细胞的端粒酶促使细胞扩增［12］。Bmi-1通过不同的途径调控肿瘤的浸润转移:一方面Bmi-1作为细胞癌基因一旦被激活，高表达于肿瘤细胞中，通过抑制p16 INK4a的表达，参与调控细胞的增殖分裂，延长细胞的增殖期［13］使癌细胞生命周期延长，增殖旺盛。另一方面Bmi-1也可能在蛋白水平直接与肿瘤浸润转移相关因子发生作用［14］。本实验结果表明乳腺癌组织中Bmi-1的高表达与临床分级、分期及淋巴结转移有正相关性，提示Bmi-1在乳腺癌晚期发生浸润转移的过程中可能起重要作用。

Maspin在恶性病变组织中表现为低表达，Bmi-1表现为基因高表达，两者呈负相关。Maspin的低表达可激活相关基因蛋白的级联表达，为促进肿瘤细胞的浸润转移创造了条件，与Bmi-1共同作用，在乳腺癌的发生和疾病进展中发挥了重要作用。两者的联合检测成为预测乳腺癌高度转移的新分子标志物。Maspin和Bmi-1作为肿瘤基因标记物已经为恶性肿瘤的诊断和治疗提供了一种新的有效途径。

1 郑伟，吉巧红，李三强，等.Bmil-1、Notchl在乳腺癌中的表达及意义.河南科技大学学报(医学版)，2014，32:7-9.

2 Zou Z，Anisowicz A，Hendrix MJ.Maspin，a serpin with tumor-sup-pressing activity in human mammary epithelial cells.Science，1994，263:526-529.

3 刘文会，牛晓东.Maspin在恶性肿瘤浸润转移中的机制研究.医学综述，2014，20:1975-1976.

4 Sopel M，Surowiak P，Berdowska I.Nuclear maspin expression as a good prognostic factor in human epithelial ovarianearcinoma.Folia Morphol (Warsz)，2010，69:204-212.

5 Zhang M，Volpert O，Shi Yll，et al.Maspin is a¨angiogenesis inhibitor.Nat Med，2000，6:196-199.

6 Narayan M，Twining S.Focus on molecules:maspin.Exp Eye Res，2010，90:2-3.

7 张伟，王瑞月.Maspin和MMP-2在乳腺浸润性导管癌中的表达及其临床意义.中国肿瘤外科杂志，2014，6:225-229.

8 Shi HY，Zhang W，Liang R，et al.Blocking tumor growth，invasion，and metastasis by MASPIN in a syngeneic breast cancer model.Cancer Res，2001，61:6945-6951.

9 Arias AM.EpitheIial mesenchymal interactions in cancer and development.Cell，2001，105:425-431.

10 Tateishi K，Ohta M，Kanai F，et al.Dysregulated expression of stem cell factor Bmi-1 in precancerous lesions of the gastrointestinal tract.Clin Cancer Res，2006，12:6960.

11 Park IK，Morrison SJ，Clarke MF.Bmi-1，stem cells，and senescence regulation.J Clin Invest，2004，113:175-179.

12 Song IB，Zeng MS，Liao WT，et al.Bmi-1 is a novel molecular marker of nasopharyngeal carcinoma progression and immortalizes primary human nasopharyngeal epithelial cells.Cancer Res，2006，66:6225-6232.

13 Itahana K，Zou Y，Itahana Y，et al.ControI of the repIicative Iife span of human fibrobIasts by p16 and the poIycomb protein Bmi-1.MoI Cell Biol，2003，23:389-401.

14 冯艳，宋立兵，郭宝红，等.Bmi-1在乳腺癌组织中的表达及意义.癌症，2007，26:154-157.