中国烟雾病患者主动脉平滑肌肌动蛋白α2基因编码区的研究*

张 谦 刘雅萍 张 东 王 嵘 张 岩 于兰冰 张 学 赵继宗

(首都医科大学附属北京天坛医院神经外科，北京 100050)



·论著·

中国烟雾病患者主动脉平滑肌肌动蛋白α2基因编码区的研究*

张 谦 刘雅萍①张 东 王 嵘 张 岩 于兰冰 张 学①赵继宗**

(首都医科大学附属北京天坛医院神经外科，北京 100050)

目的 探讨主动脉平滑肌肌动蛋白α2(actin alpha 2，ACTA2) 编码区基因多态性/突变与中国烟雾病患者遗传易感性的关系。 方法 我院2012年6月～2013年5月经脑血管造影或磁共振血管造影检查明确诊断132例烟雾病，抽取患者的静脉血，通过聚合酶链式反应Sanger方法对外显子2～9进行直接测序分析ACTA2编码区多态性及罕见突变，对比分析人类基因突变数据库中报道的ACTA2基因突变。 结果 132例中国烟雾病ACTA2基因编码区未检测到突变。 结论ACTA2基因不是中国烟雾病患者的主要易感基因。

烟雾病；ACTA2基因； 易感基因

烟雾病是一种病因不明的以双侧颈内动脉末端及大脑前动脉、大脑中动脉起始部动脉内膜缓慢增厚，动脉管腔逐渐狭窄以至闭塞，脑底穿通动脉代偿性扩张为特征的疾病[1]。烟雾综合征为脑血管造影表现与烟雾病类似，但该类患者合并基础病，包括动脉粥样硬化、自身免疫性疾病、神经纤维瘤病、头部外伤、放射性损伤、甲状腺功能亢进等。烟雾病患者早期临床症状不明显，就诊时常存在严重的神经功能障碍，早期诊断和及时手术可以降低患者卒中风险，改善预后。烟雾病致病基因的研究不仅有助于揭示疾病的发病机制，而且为疾病的早期诊断和治疗提供依据。主动脉平滑肌肌动蛋白α2(actin alpha 2，ACTA2)基因，位于10号染色体长臂(10q23.31)，为家族性胸主动脉瘤和胸主动脉夹层的致病基因。2009年Guo等[2]进行的连锁分析和关联研究显示，ACTA2基因突变不仅可引起胸主动脉瘤和胸主动脉夹层，还可能引起烟雾病。携带ACTA2基因突变的家族成员可出现多种血管性疾病，包括烟雾病和脑卒中。本研究检测132例中国烟雾病ACTA2基因编码区外显子，旨在探讨ACTA2基因是否有突变，及其与中国烟雾病患者遗传易感性的关系。

1 材料与方法

1.1 研究对象

本研究选取我院2012年6月～2013年5月经脑血管造影或磁共振血管造影检查明确诊断的132例烟雾病。女78例，男54例。年龄3～59岁，(25.2±13.4)岁，儿童45例(年龄≤15岁)。临床表现为脑缺血101例，脑出血31例。有家族史18例，散发病例114例。

纳入标准: ①脑血管造影或磁共振血管造影检查符合烟雾病的诊断标准[3]；②患者或监护人签署知情同意书。排除标准：合并动脉粥样硬化、自身免疫性疾病、脑膜炎、脑肿瘤、唐氏综合征等可能导致继发性脑血管病变引起烟雾综合征的患者。

1.2 实验方法

1.2.1 基因组提取 采集患者静脉血2～4 ml，乙二胺四乙酸抗凝，采用基因组DNA提取试剂盒(QIAGEN)，根据说明书提取基因组DNA。

1.2.2 基因检测 选取ACTA2基因编码区外显子序列(-NM_001141945)，应用生物软件Primer 3.0 online进行引物设计，经http：//www．ncbi．nlm．nih．gov/BLAST将引物序列与基因组DNA序列进行比对，确定其特异性后由Invitrogen公司合成部合成引物。引物序列见表1。

PCR扩增：反应体系为50 μl，其中含2 μl DNA模板(20 ng/μl)，上游、下游引物(浓度：20 μmol/L)各1 μl，Premix La Taq (TaKaRa)溶液25 μl，补齐ddH2O至50 μl。PCR条件：94 ℃预变性5 min后进入主循环，94 ℃变性30 s，59～62 ℃退火30 s，72℃延伸60 s，35个循环后置72 ℃再7 min。扩增产物由北京梓熙生物基因有限公司进行测序。

表1 PCR扩增使用引物

F代表上游引物，R代表下游引物，ACTA2外显子1为非编码外显子

1.2.3ACTA2突变表型检索 检索人类基因突变数据库(Human Gener Mutation Database, HGMD)，网址：http：//www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php，获得已知ACTA2基因突变情况。

2 结果

截止2014年12 月20日,HGMD收录45种ACTA2基因突变，包括41种错义突变，1种无义突变，2种剪切位点突变和1种微缺失。致病突变可以引起胸主动脉疾病、冠状动脉疾病、脑血管病、精神分裂症等，这些突变包括p.D26Y，p.G38R，p.R39C，p.R39H，p.H42N，p.V45L，p.M49V，p.Q61R，p.P72Q，p.D82E，p.T108M，p.N113T，p.N117T，p.R118Q，p.Y135H，p.A140V，p.Y145C，p.R149C，p.V154A，p.G160D，p.V161A，p.R179C，p.R179H， p.R179L，p.R185Q，p.V203I，p.R212Q，p.E243K，p.P245H，p.I250L，p.R258C，p.R258H，p.G270E，p.G275A，p.R292G，p.S302A，p.G304R，p.R314*，p.T326N，p.K328N，p.T353N，p.G368R, c.369+1G>A, c.616+1G>T, c.1019_1020delCT。在这些突变中, 9种错义突变，包括p.R39H、p.R179C、p.R179H、p.R179L、p.R212Q、p.P245H、p.I250L、p.R258H、p.T326N与脑血管病有关，见表2。

132例烟雾病ACTA2基因编码区外显子直接测序未发现突变，包括先前报道的可能引起脑卒中的突变[2，4～7]，即本研究132例烟雾病中，ACTA2基因编码蛋白p.R39、 p.R179、p.R212、p.P245、p.I250、p.R258、p.T326均未改变，见图1～7。

3 讨论

本研究通过对132例中国烟雾病患者进行ACTA2基因编码区外显子的检测，未发现中国烟雾病患者ACTA2基因编码外显子任何突变。1969年Suzuki和Takaku正式命名烟雾病[9]。烟雾病的病因至今仍不明确，遗传学研究已发现了多个烟雾病相关基因位点，包括3p24．2-26、6q25、8q23、12p12和17q25等[10]，RNF213、ACTA2、BRCC3、GUCY1A3等基因与烟雾病和烟雾综合征发病相关[2，11～13]。

表2 ACTA2基因9种与脑血管病相关的突变

图1～7 ACTA2基因直接测序结果显示，p.R39、 p.R179、p.R212、p.P245、p.I250、p.R258、p.T326均未发现突变，方框内3个核苷酸编码对应的氨基酸

烟雾病起病隐匿，临床表现复杂，轻者可无明显临床症状或仅以头痛为主要表现，随着疾病进展，可出现短暂性脑缺血发作、脑梗死、癫痫和脑出血等表现。缺血型烟雾病多见于儿童，发病高峰为10岁以前；出血型烟雾病多见于成年人，发病高峰在40岁左右，是我国儿童和青壮年脑卒中常见的病因之一。目前，尚无有效药物。治疗以脑血运重建手术为主，包括直接搭桥术、多种间接搭桥术及联合搭桥术等。对有脑缺血表现的烟雾病患者行血管重建术可以降低短暂性脑缺血发作频率以及脑梗塞的风险，提高生活质量和改善脑功能的长期预后[1]。

Liu等[11]发现RNF213基因是日本烟雾病患者的主要致病基因。p.R4810K突变(rs112735431)明显增加了日本烟雾病患者的发病风险，同时发现约23%的中国烟雾病患者存在p.R4810K突变，明显低于日本烟雾病患者(23% vs. 90%)。Wu等[14]在170例中国烟雾病患者的验证研究中发现13%的中国烟雾病患者存在RNF213基因p.R4810K突变。以上2项研究均提示RNF213基因之外的其他遗传因素或环境因素可能与中国烟雾病的发病有关。

ACTA2基因位于10号染色体长臂-10q23.31，为家族性胸主动脉瘤和胸主动脉夹层的致病基因，ACTA2基因(NM_001141945)由9个外显子组成，编码肌动蛋白α2, 是哺乳动物中存在的 6 种肌动蛋白亚类之一，主要分布于肌细胞，是收缩器的主要成分。2009年Guo等[2]进行的连锁分析和关联研究显示，ACTA2基因突变不仅可引起胸主动脉瘤和胸主动脉夹层，还可能引起脑卒中和烟雾病。可能的遗传学机制是ACTA2基因突变，引起血管平滑肌细胞异常迁移，从而导致烟雾病的发生。Milewicz等[5]报道5例有p.R179H突变的患者存在心血管系统疾病，同时合并颈内动脉海绵窦段至床突段扩张、颈内动脉末端狭窄、脑梗死等类似烟雾病的脑血管改变。Roder等[15]对欧洲中部68例散发性烟雾病ACTA2基因9个外显子的测序研究显示，1例烟雾病患者存在6号外显子p.R179H突变(杂合子)。

Shimojima等[16]对53例日本烟雾病的验证研究显示未发现ACTA2基因是烟雾病的主要易感基因。Hu等[17]对56例中国散发烟雾病的ACTA2基因进行检测，未发现ACTA2基因外显子突变。Hu等的研究不包括家族性烟雾病患者，而Guo等报道的ACTA2基因突变引起胸主动脉瘤、烟雾病和脑卒中主要见于家族性患者。为进一步发现中国烟雾病患者ACTA2基因编码区外显子突变，我们选取132例烟雾病，其中包括18例家族性和114例散发性烟雾病，包括儿童和成人患者，以及缺血型和出血型烟雾病患者。全部患者ACTA2基因编码区外显子均未发现任何突变，提示ACTA2基因不是中国烟雾病患者的主要致病基因，表明亚洲和欧美烟雾病患者存在遗传异质性。中国和欧美烟雾病患者的流行病学和临床特点存在明显差异[1]，这种临床表型的差异可能与遗传异质性有关。随着烟雾病和烟雾综合征致病基因和易感基因的深入研究，未来可能依据分子遗传学标记将此类疾病进行新的分类，为不同基因突变导致的烟雾病和烟雾综合征手术方式选择和预后评估提供新的依据。

本研究存在的不足之处：第一，本研究仅对ACTA2基因编码区外显子进行了测序，非翻译区外显子、启动子区域及内含子的改变并没有检测；第二，本研究样本量较小，检验效能不高。

总之，对ACTA2基因编码区直接测序研究结果提示ACTA2基因不是中国烟雾病患者的主要易感基因，这与高加索人群有所不同，我们的结果需要进一步在各种族、多中心、大样本人群中进行验证。

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16 Shimojima K, Yamamoto T.ACTA2 is not a major disease-causing gene for moyamoya disease. J Hum Genet,2009,54(11):687-688.

17 Hu FY, Zheng HB, Xu YM, et al.ACTA2 is not a major genetic risk gene for Chinese patients with moyamoya disease. Int J Stroke,2013,8(6):E35.

(修回日期：2015-06-14)

(责任编辑：李贺琼)

Analysis of Coding Exon ofACTA2 in Chinese Patients with Moyamoya Disease

ZhangQian*,LiuYaping,ZhangDong*,etal.

*DepartmentofNeurosurgery,BeijingTiantanHospitalofCapitalMedicalUniversity,Beijing100050,China

ZhaoJizong,E-mail:zhaojz205@163.com

Objective To study variations of the coding exons ofACTA2 (actin alpha 2) and to investigate the genetic susceptibility in Chinese patients with moyamoya disease. Methods A total of 132 blood samples from Chinese patients with moyamoya disease were collected. The eight coding exons and flanking intronic regions ofACTA2 were amplified and sequenced. Pathogenic mutation ofACTA2 reported in the Human Gene Mutation Database was summarized. Results We were not able to detect any previously described mutations inACTA2 in 132 Chinese patients with moyamoya disease. ConclusionACTA2 is not a major genetic susceptible gene for Chinese patients with moyamoya disease.

Moyamoya disease; Actin alpha 2(ACTA2); Susceptible gene

首都临床特色应用研究(项目编号：Z13110200680000)

R743

A

1009-6604(2015)11-1041-04

10.3969/j.issn.1009-6604.2015.11.024

2015-02-13)

**通讯作者，E-mail:zhaojz205@163.com

①(中国医学科学院基础医学研究所医学遗传学系，北京 100005)