左旋薄荷酮抗抑郁作用及机制研究

薛劲松，李鸿雁，傅 强，马世平

中国药科大学中药药理教研室，南京 210009

左旋薄荷酮抗抑郁作用及机制研究

薛劲松，李鸿雁，傅 强*，马世平*

中国药科大学中药药理教研室，南京 210009

目的：研究左旋薄荷酮（MTN）的抗抑郁作用及可能机制。方法：以开野实验、强迫游泳实验、悬尾实验、糖水偏好实验对ICR小鼠进行行为学观察，探讨左旋薄荷酮对抑郁模型小鼠行为学的改善作用，同时检测小鼠血清皮质酮及皮质中糖皮质激素受体（GR）、脑源性神经营养因子（BDNF）含量的变化。结果：左旋薄荷酮15、30 mg·kg-1能显著缩短小鼠强迫游泳、悬尾不动时间，显著提高慢性不可预知温和刺激（CUMS）小鼠糖水偏好值，并能显著降低CUMS小鼠血清皮质酮含量、升高GR mRNA和BDNF的表达。结论：左旋薄荷酮具有抗抑郁作用，其抗抑郁机制可能与抑制下丘脑-垂体-肾上腺轴（HPA轴）过度活化、促进皮质BDNF的表达有关。

左旋薄荷酮；慢性不可预知温和刺激；GR；皮质酮；BDNF

抑郁症是一种应激相关的情感障碍，给病人带来痛苦，同时给社会带来了很大的经济负担[1]。薄荷为唇形科草本植物薄荷的地上部分，辛、凉，归肺、肝经，具有疏散风热、清热利咽、祛风透疹、疏肝解郁的功效。左旋薄荷酮广泛存在于薄荷挥发油中，有研究表明左旋薄荷酮具有清凉、镇痛、止痒的功效[2]。本实验通过急性实验模型初步证实左旋薄荷酮可能具有抗抑郁功效，运用糖水偏好观察左旋薄荷酮对CUMS小鼠兴趣缺失的改善作用，并进一步检测其对CUMS小鼠血清皮质酮、皮质GR mRNA以及BDNF表达的影响。

1 材 料

1.1 仪器

酶标仪（Thermo）；电子天平（北京赛多利斯天平有限公司）；冷冻离心机（Sigma公司）；CFX Con-nentTMReal-Time PCR检测系统。

1.2 药品与试剂

盐酸氟西汀（FLU）（常州四药制药有限公司，批号:20130701)；左旋薄荷酮（97%，上海将来制药有限公司，批号：J140320001）；MaxVisionTMHRP-Polymer IHC试剂盒（福州迈新生物技术有限公司）；兔抗鼠BDNF多克隆抗体（CST公司）；水合氯醛（国药集团化学试剂有限公司）；EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix试剂盒（北京全式金生物技术有限公司）；RNA提取试剂、HiScript誖Q RT SuperMix for qPCR（南京诺维赞生物科技有限公司）。

1.3 动物

清洁级雄性ICR小鼠由扬州大学比较医学中心提供，生产许可证号：SCXK（苏）2012-0004，体重18～22 g，动物自由饮水、饮食，分笼饲养，室温（25± 1）℃，保持正常昼夜节律。

2 方 法

2.1 急性实验

2.1.1 分组与给药 40只ICR小鼠随机分为四组，每组10只，分别为空白对照组、阳性药FLU组（10 mg·kg-1），MTN低、高剂量组（15、30 mg·kg-1），按0．1 mL/10 g灌胃1次/天，连续给药7 d。

2.1.2 开野实验 末次给药1 h后，将小鼠置于开野设备中，适应2 min后，记录小鼠在随后4 min内的水平穿格次数和站立次数。

2.1.3 强迫游泳实验 于末次给药1 h后，将小鼠放入玻璃器皿（高20 cm，直径14 cm）中，水深10 cm，水温保持25℃，适应2 min后，记录后4 min的不动时间，不动状态以小鼠漂浮于水面静止不动或只作轻微动作保持呼吸作为评判标准。

2.1.4 悬尾实验 末次给药1 h后，在距尾尖1 cm处用胶带将小鼠悬挂于悬尾装置中，观察6 min，并记录后4 min小鼠不动时间。

2.2 慢性不可预知温和刺激

2.2.1 分组与给药 50只ICR随机分为5组，分别为空白对照组、模型组、阳性药FLU组（10 mg·kg-1），MTN低、高剂量组（15、30 mg·kg-1），每天给药一次，给药体积为0．1 mL/10 g，小鼠适应一周后开始造模。

2.2.2 模型建立 参照文献方法[3]建立模型。空白对照组小鼠不给予任何刺激，其他组小鼠给予每天随机选取2～3种刺激，造模6周。实验刺激因子包括：禁食（24 h）、禁水（24 h）、噪音刺激（5 min）、摇晃鼠笼（5 min）、昼夜颠倒、倾斜鼠笼（45°，12 h）、夹尾（距离尾根部1 cm处夹1 min）、潮湿垫料、异物刺激。

2.2.3 糖水偏好实验 小鼠禁食禁水24 h，每笼给予两瓶溶液：1瓶纯水，1瓶蔗糖水（1%，w/v），检测12 h内纯水和糖水消耗量。实验中，为避免小鼠习惯性的饮用一个位置水瓶对实验的干扰，6 h后交换2个水瓶的位置。实验分别在第1周、第4周和第7周测定糖水偏好值，其计算公式：糖水偏好值=（糖水消耗量/总消耗量）×100%。

2.3 生化指标的测定

2.3.1 血清皮质酮的检测 6周慢性实验后，小鼠取血参考文献[4]的方法进行皮质酮的检测。取小鼠血清0．2 mL，加入0．2 mL 0．04 mol·L-1NaOH溶液，同时加入2 mL二氯甲烷震荡分层，二氯甲烷层中加入1 mL发光液（浓硫酸∶无水乙醇，7∶3），静置30 min后，弃去二氯甲烷层，呈色液测定荧光值。选定的测定条件：λex=470 nm，λem=525 nm。通过同样的方法绘制标准曲线，计算样品皮质酮的含量。

2.3.2 RT-PCR检测皮质中GR mRNA的表达

小鼠麻醉后，断头取脑并分离出皮质。Trizol试剂提取总 RNA，参照 EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix试剂盒逆转录为cDNA，并参照HiScript誖Q RT SuperMix for qPCR试剂盒说明书进行PCR扩增。GR上游引物序列：5′-AGCTCCC-CCTGGTAGAGAC-3′，下游引物序列：5′-GGTGAA-GACGCAGAAACCTT-3′；β-actin，上游引物序列：5′-TCT GGC ACC ACA CCT TCT A-3′；下游引物序列：5′-AGG CAT ACA GGG ACA GCA C-3′。

2.3.3 免疫组化测定皮质中BDNF的表达 各组小鼠以水合氯醛麻醉后，打开胸腔，暴露心脏，左心室插管并剪开右心耳，灌注PBS溶液洗去血液，再灌注4%多聚甲醛进行固定，取脑，组织脱水制成蜡块。脑切片以羊血清封闭，加入50 μL的BDNF抗体孵育37 min，PBS清洗并按试剂盒说明加入试剂，最后用二氨基联苯胺（DAB）染色。通过Image-Pro Plus（IPP 6．0）软件测定光密度（OD）值。

2.4 统计学处理

3 结 果

3.1 MTN对小鼠开野实验的影响

实验结果见表1，给药7 d后，与空白对照组相比，FLU组及MTN低、高剂量组的小鼠穿格次数和站立次数均无显著变化。表明该药对小鼠自主活动无明显影响。

表1 MTN对急性实验小鼠开野的影响（±s，n=10）

表1 MTN对急性实验小鼠开野的影响（±s，n=10）

组别剂量/mg·kg-1交叉次数站立次数空白对照组-72．8±16．16 20．2±4．64 FLU组10 73．7±16．80 21．2±5．35 MTN组 低15 75．8±21．08 20．1±6．23高30 74．1±15．77 22．4±7．01

3.2 MTN对小鼠强迫游泳的影响

实验结果见图1，与空白对照组比较，FLU组和MTN各剂量组均能缩短小鼠强迫游泳的不动时间（P＜0．05或P＜0．01）。

图1 MTN对小鼠强迫游泳实验不动时间的影响（±s，n=10）

3.3 MTN对小鼠悬尾的影响

实验结果见图2，经过7 d给药后，与空白对照组比较，FLU组和MTN各剂量组均能缩短小鼠在悬尾实验中的不动时间（P＜0．05或P＜0．01）。

3.4 MTN对CUMS小鼠糖水偏好的影响

如图3所示，经过6周的慢性不可预知温和刺激后，模型（CUMS）组小鼠与空白对照组相比，糖水偏好值显著下降（P＜0．001），而与模型组比较，MTN低、高剂量组可显著提高小鼠糖水摄入量（P＜0．05）。实验结果表明MTN可改善CUMS的抑郁症的核心症状：快感缺失。其具有一定的抗抑郁作用。

3.5 MTN对CUMS小鼠血清皮质酮含量的影响

CUMS小鼠的血清皮质酮与空白对照组相比明显升高（P＜0．001)，FLU和MTN（15、30 mg·kg-1）均能显著降低CUMS小鼠血清皮质酮的含量 （P＜0．05)，结果见图4。

图2 MTN对小鼠悬尾实验不动时间的影响（±s，n=10）

图3 MTN对慢性不可预知温和刺激小鼠糖水偏好的影响（±s，n=10）

图4 MTN对慢性不可预知温和刺激小鼠血清皮质酮的影响（±s，n=10）

3.6 MTN对CUMS小鼠皮质GR mRNA表达的影响

PCR检测小鼠皮质GR mRNA的表达结果显示，与空白对照组相比，模型组GR mRNA的表达显著降低（P＜0．01）；与模型组相比，FLU组和MTN低、高剂量组GR mRNA表达水平有显著提高（P＜0．05或P＜0．01）。见图5。

图5 MTN对慢性不可预知温和刺激小鼠皮质GR mRNA表达的影响（±s，n=6）

3.7 MTN对CUMS小鼠皮质BDNF表达的影响

免疫组化结果如图6和表2所示，模型组小鼠皮质BDNF与空白对照组比较显著下降（P＜0．001），而MTN组（15、30 mg·kg-1）可显著增加CUMS小鼠皮质中BDNF的表达（P＜0．01）。

图6 MTN对慢性不可预知温和刺激小鼠皮质BDNF水平的影响（±s，n=6）

表2 MTN对慢性不可预知温和刺激小鼠皮质BDNF表达的影响（±s，n=6）

表2 MTN对慢性不可预知温和刺激小鼠皮质BDNF表达的影响（±s，n=6）

注：与空白组比较，###P＜0．001；与模型组比较，**P＜0．01

组别剂量/mg·kg-1光密度值（OD）空白对照组-0．056±0．0094 CUMS组-0．031±0．0095###FLU组10 0．055±0．0156**MTN组 低15 0．046±0．0064**高30 0．047±0．0068**

4 讨 论

开野实验被用于探讨药物对动物自发活动的影响。强迫游泳和悬尾都是行为绝望模型，反映了小鼠在不可挣脱条件的行为绝望，表现为不动时间的延长，具有可靠性和预知性，用于抗抑郁药的筛选。本实验中MTN能够明显降低行为绝望模型小鼠的不动时间，表明其对抑郁行为有一定的改善作用。

慢性不可预知温和刺激是抑郁症的经典模型，该模型将实验动物长期置于一系列不可预知、温和的环境中，类似人类抑郁症的形成过程。其模型可靠、有效，能模拟人类抑郁症核心症状：快感缺失，常用于抑郁症的药效及机理研究[5]。本实验中的ICR小鼠经过6周CUMS刺激后，糖水偏好值明显降低，而给予MTN后小鼠则能改善这一快感缺失行为。

HPA轴（下丘脑-垂体-肾上腺轴）功能亢进假说是抑郁症重要的发病机制，GR广泛分布于皮质、海马、下丘脑，是糖皮质激素发挥生理药理作用的重要靶点[6]。当GR功能障碍时，HPA轴的负反馈机制受到抑制，糖皮质激素水平持续升高，最终导致抑郁症的发生[7]。研究表明，糖皮质激素水平升高是抑郁症的病理改变之一，而通过增加GR表达可以起到明显的抗抑郁作用[8]。实验结果显示，相对于CUMS小鼠，MTN组小鼠（15、30 mg·kg-1）血清皮质酮水平显著降低，皮质内GR mRNA表达显著升高，这表明MTN可能通过改善CUMS小鼠HPA轴功能，达到抗抑郁的作用。

此外，GR下降引起的糖皮质激素过度升高，还会影响BDNF表达及 BDNF调控的神经发生[9]。BDNF在中枢神经系统中含量丰富，可促进多种类型神经元分化、增值、营养和成熟，其水平的降低会引起皮质的萎缩，从而引起人或实验动物抑郁样行为[10]。有研究发现，应激小鼠皮质BDNF含量下降，且抑郁症患者脑内BDNF水平也显著降低，抗抑郁药则逆转了这一过程[11]。在本研究中，CUMS小鼠皮质BDNF显著降低，而给予MTN后则能缓解这种变化，结果证实调控BDNF的表达是MTN发挥抗抑郁作用的重要机制。

综上所述，MTN具有抗抑郁作用，其作用机制可能与抑制HPA轴过度活化，增加BDNF的表达有关。

[1]Lepine JP,Briley M.The increasing burden of depres-sion[J].Neuropsychiatr Dis Treat,2011,7(1):3-7.

[2]Hong CZ,Shellock FG.Effects of topically applied coun-terirritant (Eucalyptamint)on cutaneous blood flow and on skin and muscle temperatures.A placebo-controlled study[J].Am J Phys Med Rehabil,1991,70(1):29-33.

[3]Zhang Y,Gu F,Chen J,et al.Chronic antidepressant administration alleviates frontal and hippocampal BDNF deficits in CUMS rat[J].Brain Res,2010,1366:141-8.

[4]熊 忠，索有瑞.血浆和组织中皮质酮的荧光测定法[J].光谱学与光谱分析，1998，18（2）：237-9.

[5]杨新华，刘小群，尹霞云，等.抑郁症快感缺失：概念及其神经生物学基础 [J].中国临床心理学杂志，2013，21（5）：747-50.

[6]王德杰，刘兴国，张 东.糖皮质激素受体的研究进展[J].现代生物医学进展，2010，10（8）：1592-4.

[7]秦红宁，亓晓丽.抑郁症糖皮质激素受体功能障碍机制：基因单核苷酸多态性及分子伴侣的作用[J].心理科学进展，2013，21（11）：1949-55.

[8]Pariante CM.Risk factors for development of depression and psychosis:Glucocorticoid Receptors and Pituitary Implications for Treatment with Antidepressant and Glu-cocorticoids[J].Ann NY Acad Sci,2009,1179:144-52.

[9]Kumamaru E,Numakawa T,Adachi N,et al.Gluco-corticoid suppresses BDNF-stimulated MAPK/ERK pathway via hinhibiting interaction of Shp2 with TrkB [J].FEBS Lett,2011,585(20):3224-8.

[10]彭 希，曾 南，龚锡萍，等.逍遥散抗抑郁作用的BDNF/CREB信号机制 [J].中药药理与临床，2012，28（3）：9-12.

[11]Martinowich K,Manji H,Lu B.New insights into BDNF function in depression and anxiety[J].Nat Neu-rosci,2007,10(9):1089-93.

Antidepressant-like Effects of L-Menthone in Depressed Mice and Its Possible Mechanisms

XUE Jin-song,LI Hong-yan,FU Qiang*,MA Shi-ping*
Department of Pharmacology of Chinese Materia Medica,China Pharmaceutical University,Nanjing 210009

Objective:To study the antidepressant-like effects of L-Menthone (MTN)on mice model of depression and the underlying mechanisms.Methods:ICR mice behavioral changes were observed in open field test(OFT),forced swimming test(FST),tail suspension test(TST)and sucrose preference test(SPT)to explore the potential antidepressant-like effects of MTN in depressed mice.Serum corticosterone(CORT), glucocorticoid receptor (GR)and brain-derived neurotrophic factor (BDNF)were determined to illuminate the exact mechanisms.Results:Mice treated with MTN (15 or 30 mg·kg-1)decreased the immobility time in FST and TST compared with the control mice.Meanwhile,the MTN group significantly increased the sucrose intake versus the chronic unpredictable mild stress (CUMS)group.In comparison with the CUMS mice,the serum CORT level in the mice with long-term administration of MTN was decreased,while the cortical BDNF protein and GR mRNA were significantly increased.Conclusion:The antidepressant-like effects of MTN in depressed mice might be related to the regulation of hypothalamus-pituitary-adrenal(HPA)axis and BDNF levels.

L-Menthone;Chronic unpredictable mild stress (CUMS);Glucocorticoid receptor;Corticos-terone;Brain-derived neurotrophic factor

R965.1

A

1673-7806（2015）03-238-04

薛劲松，男，研究生 E-mail:xjs810955322@163.com

*通讯作者马世平，男，教授，博导 E-mail:spma@cpu.edu.cn傅强，男，副教授 E-mail:fuqiang@cpu.edu.cn

2015-03-02

2015-03-30