猪伪狂犬病病毒和猪圆环病毒2型多重PCR检测方法的建立与初步应用

郭晓秋，曲哲会，刘　涛（信阳农林学院动物科学系，河南信阳464000）

猪伪狂犬病病毒和猪圆环病毒2型多重PCR检测方法的建立与初步应用

郭晓秋，曲哲会，刘涛
（信阳农林学院动物科学系，河南信阳464000）

摘要：为了建立可同时检测猪伪狂犬病病毒（PRV）和猪圆环病毒2型（PCV-2）的多重PCR检测方法，本研究根据GenBank中登录的PRV gE基因和PCV-2 ORF2基因的核苷酸序列，分别设计了2对特异性引物PRV-S/PRV-A和PCV-2-S/PCV-2-A，产物分别为270 bp和189 bp。检测结果显示，该方法具有较高特异性，检测PRV和PCV-2的DNA最低量均为1×10-4μg/μL。对136份临床上疑似为PRV和PCV-2感染病料样品进行检测的结果表明，本研究建立的多重PCR检测方法可用于临床上PRV和PCV-2引起的单纯或混合感染的传染病病原学诊断。

关键词：猪伪狂犬病病毒；猪圆环病毒2型；多重PCR

猪伪狂犬病（PR）是由猪伪狂犬病病毒（Pseu⁃dorabies virus，PRV）引起的一种急性传染病，临床上以妊娠期母猪感染后引起流产、死胎及木乃伊胎，仔猪感染后出现神经症状为主要特征，且病死率可达100%。猪圆环病毒病（Porcine circovirus diseases，PCVD）是指由圆环病毒2型（PCV-2）为主要病原、单纯或继发（或混合）感染其他致病微生物而引起的一系列综合征的总称。PCV-2是引起仔猪断奶后多系统衰竭综合征（PMWS）和母猪繁殖障碍、断奶和育肥猪的呼吸道疾病，猪皮炎和肾病综合征（PDNS）以及猪的先天性震颤的主要病原。近年来，PR和PCVD已经成为威胁我国养猪业最主要的传染病之一，不仅导致饲料转化率降低，生长缓慢，而且由PR和PCV-2引起的混合感染或继发感染其他猪病的暴发与流行，造成治疗费用增加，严重者可引起大批猪只死亡，给养猪业带来了空前巨大的经济损失，严重制约了养猪业的持续健康发展。

由于常规的病原学和血清学诊断方法存在操作繁杂，耗时长，灵敏度低等不足，难以用于混合感染时两种疾病的早期快速诊断。而多重PCR技术可对多个目的基因同时进行扩增的诊断方法，具有快速、敏感、高效、易于操作等优点，已广泛用于多种疫病的实验室诊断中。基于以上原因，本研究依据PRV和PCV-2保守基因序列，设计并合成了2对特异性引物，建立了可以同时检测PRV和PCV-2的多重PCR检测方法，通过初步临床应用，可完全满足临床上由PRV和PCV-2引起的单纯或混合感染的准确诊断。

1　材料与方法

1.1病毒株与病料猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪圆环病毒2型（PCV-2）、猪圆环病毒1型（PCV-1）、猪瘟病毒（CSFV）、猪细小病毒（PPV）和猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）均为北京世纪元亨动物防疫技术有限公司的PCR检测试剂盒阳性对照。136份疑似为PRV和PCV-2感染的病料（包括有血清、淋巴结、肺脏、脾脏和脑组织）为2012-2013年期间信阳农林学院动物疫病检测实验室收集保存。

1.2主要试剂细胞/组织基因DNA提取试剂盒（离心柱型）和Gen Clean琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（离心柱型），购自上海捷瑞生物工程有限公司；2×Power Taq PCR MasterMix和DNA Marker DL-2 000，购自百泰克生物技术（北京）有限公司；琼脂糖为BBI公司生产；其他试剂均为国产分析纯。

1.3引物设计利用DNAMAN软件分别对GenBank 中12株PRV和12株PCV-2基因序列进行同源性比较，分别选择PRV gE基因和PCV-2的ORF2基因保守区域，利用生物软件Primer 5.0设计2对引物，具体序列如下，PRS：5′-ATGGGCATCGGCGACTACCT-3′；PRV-A：5′-GCGAGAAGAGCTGGGAGTGGA-3′；PCV-2-S：5′-GTTATGGTATGGCGGGAGG-3′；PCV-2-A：5′-CCGCTGTGCCCTTTGA-3′，预计PRV扩增片段为270 bp，PCV-2扩增片段为189 bp。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

表1　PCR检测引物序列

1.4病料样品的处理及基因组DNA的提取选择发病动物血清、肺脏、脾脏、淋巴结和流产胎儿为检测样品，具体处理方法参照文献[1]。参照组织/细胞基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）使用说明书提取病料中的基因组DNA。

1.5单项PCR反应PCR反应体系（25 μL）：PCR反应液12.5 μL、DNA模板3 μL、PRV-S（10 μmol/L）/PRV-A（10 μmol/L）（或PCV-2-S/PCV-2-A）各0.75 μL、加无菌去离子水至25 μL。PCR反应程序：95℃5 min，95℃30 s、55℃30 s、72℃ 30 s、共35个循环，72℃7 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，紫外灯下观察结果。

1.6PRV和PCV-2的多重PCR检测按照单项PCR反应体系，其中引物PRV-S、PRV-A（10 μmol/L）、PCV-2-S（10 μmol/L）、PCV-2-A（10 μmol/L）各0.75 μL。反应条件同单项PCR反应。分别对PRV阳性对照、PCV-2阳性对照以及PRV和PCV-2混合物进行检测。

1.7特异性试验利用该多重PCR检测方法同时对CSFV、PRRSV、PCV-1和PPV进行检测，以PRV和PCV-2混合物作为阳性对照，以确定该方法的特异性。

1.8敏感性试验利用微量分光光度计分别对提取的PRV和PCV-2阳性对照DNA进行含量测定，然后稀释、混合成浓度均为1 μg/μL，按照10倍进行倍比稀释，利用该多重PCR检测方法对DNA含量依次为1 μg/μL～1×10-6μg/μL进行检测，以确定该方法的敏感性。

1.9初步临床应用按照步骤1.4将2012-2013年收集的136份疑似PRV或PCV-2感染病料进行处理，按照该多重PCR检测方法进行检测，同时以PRV和PCV-2的单项PCR检测方法和商品试剂盒进行检测，将检测结果进行比较、分析，以确定该方法的临床应用效果。

2　结果

图1　单项PCR分别检测PRV和PCV- 2结果

2.1单项PCR检测PRV和PCV-2结果如图1所示，以提取PRV阳性对照的DNA为模板，以引物PRV-S/PRV-A为检测引物进行PCR扩增，结果显示，扩增出特异的270 bp的条带，经过序列测定，与AP207700、AY170318和AY249861的同源性分别为98.15%、99.22%和98.81%。以提取PCV-2阳性对照的DNA为模板，以引物PCV-S/PCV-A为检测引物进行PCR扩增，结果显示，扩增出特异的189 bp的条带，经过序列测定，与AF027217、AY641542和GU124593同源性分别为97.77%、98.24%和97.93%。

2.2多重PCR检测PRV和PCV-2结果如图2所示，以提取的PRV和PCV-2混合物DNA为模板，以及分别提取PRV和PCV-2的DNA为模板，利用引物PRV-S/PRV-A和PCV-2-S/PCV-2-A混合物进行多重PCR检测，分别出现了与预计相符（270 bp和189 bp）的特异片段，2种病毒混合物检测后，同时出现了大小差异明显的270 bp和189 bp片段。

图2　多重PCR检测PRV、PCV- 2及混合物结果

2.3特异性试验结果结果如图3所示，PRV和PCV-2的DNA混合物，经多重PCR检测，出现了270 bp和189 bp特异2条目的片段，而CSFV和PRRSV的RNA反转录产物、PPV和PCV-1的DNA为模板，多重PCR检测结果均为阴性。说明PRV和PCV-2的多重PCR检测方法具有良好的特异性。

2.4敏感性试验结果利用微量分光光度计，将分别提取的PRV和PCV-2的DNA进行含量测定，然后稀释、混合成总浓度均为1 μg/μL，并进行10倍稀释，依次为1×10-1μg/μL、1×10-2μg/μL、1×10-3μg/μL、1× 10-4μg/μL、1×10-5μg/μL，分别进行多重PCR检测。结果如图4所示，PRV和PCV-2的DNA最小检测量均为1×10-4μg/μL。

图3　多重PCR检测方法的特异性试验结果

图4　多重PCR检测方法的敏感性试验结果

表2　136份临床病料多重PCR、单项PCR及商品试剂盒检测结果的比较

2.5多重PCR检测方法对临床病料检测结果分别利用多重PCR检测方法，PRV和PCV-2的单项PCR检测方法以及PRV和PCV-2商品试剂盒对136份临床疑似PRV和PCV-2单纯或混合感染的病料进行检测，具体结果见表2，PRV和PCV-2多重PCR检测结果与单项结果符合率为100%，PRV和PCV-2多重PCR检测结果与PRV和PCV-2商品试剂盒检测结果比较来看，PCV-2单纯感染检测结果符合率为100%，PRV单纯感染检测结果符合率为95.92%，PRV和PCV-2混合感染检测结果符合率为96.00%。说明本研究建立的PRV和PCV-2多重PCR检测结果完全可以满足临床诊断的要求。

3　讨论

随着分子生物学的不断发展，PCR检测方法以其灵敏性高、特异性强、操作时间短等特点，已经广泛应用于动物传染病病原体检测方面[2-4]。但由于临床经常出现多病原的混合感染的病例，因此研究快速而灵敏地鉴别诊断多种病原体的诊断方法尤为重要。多重PCR技术可对在同一体系中的多个目的基因进行扩增的，不仅具有单项PCR方法的快速、敏感、高效、易于操作等优点，而且对临床混合感染的鉴别诊断尤为有效，并且与单项PCR相比，大大节省诊断试剂费用和操作时间[5]。本研究建立的PRV和PCV-2的多重PCR检测方法，通过特异性、敏感性和初步临床应用来看，可以特异、准确地检测PRV和PCV-2的DNA，PCR产物分别为270 bp和189 bp，通过与Marker DL-2 000比较，可明显分别位于250 bp的上下，最低可以检测到DNA量均为1× 10-4μg/μL，通过对临床采集136份病料检测，PRV 和PCV-2多重PCR检测结果与单项结果及PRV和PCV-2商品试剂盒检测结果比较来看，该方法完全可以满足临床病原体诊断的要求。

PCR检测方法的准确性与目的基因的选择及引物设计有很大关系，本研究选择了PRV的gE基因和PCV-2的ORF2基因作为参考基因。虽然目前已有PRV的PCR检测方法的建立，但引物设计大多选择gB基因、gD基因和TK基因等保守部分[5-7]，无法避免疫苗毒的干扰造成结果假阳性问题。本研究选择gE基因是PRV的主要毒力因子，作用在于能降低PRV对猪神经系统的侵袭能力，而且是PRV复制所必需的，而且目前国内使用的PRV弱毒疫苗至少为gE基因缺失苗，所以利用gE基因序列作为参考基因，选择保守区域设计合成的引物，建立的PCR检测方法完全解决了疫苗毒对检测结果的干扰问题。PCV有PCV-1和PCV-2 2个血清型。PCV-1在猪体内普遍存在，无致病性，PCV-2具有致病性，是引起PMWS、PDNS以及猪的先天性震颤等混合感染的主要病原。PCV-1和PCV-2的基因同源性较高，如果引物设计不当，容易造成误检，所以本研究比较GenBank中多个PCV-1和PCV-2的基因序列同源性，设计了特异检测引物PCV-2-S/PCV-2-A，经特异性试验表明，可以鉴别PCV-1和PCV-2。

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Thedevelopment and preliminary application of multiplex PCR for detection of PRV and PCV- 2

GUO Xiao-qiu，QU Zhe-hui，LIU Tao
（Department of Animal Science，Xingyang College of Agriculture and Forestry，Xinyang 464000，China）

Abstract：To establish the assay for detections of pseudorabies virus（PRV）and Porcine circovirus type 2（PCV-2），a multi⁃plex RT-PCR was developed with two pair specific primers of PRV-S/PRV-A and PCV-2-S/PCV-2-A designed for detecting PRV and PCV-2 based on the gE gene and ORF2 gene sequences in GenBank respectively.The results showed that the assay was able to detect PRV and PCV-2 simultaneously by amplifying DNA fragments of 270 bp and 189 bp，respectively.The sensitivity of the assay was 1×10-4μg/μL of DNA. Our result of the 136 tested clinical sample suggest that the Multiplex PCR detection meth⁃ods can be used to detect the PRV and PCV-2.

Key words：Pseudorabies Virus；Porcine circovirus type 2；Multiplex PCR Corresponding author：LIU Tao

通讯作者：刘涛，E-mail：decai178@163.com

作者简介：郭晓秋（1979-），女，讲师，硕士，主要从事动物营养与饲料的教学与科研工作，E-mail:guoxiaoqiu_1979@163.com

基金项目：信阳市科技攻关项目（20130017）

收稿日期：2014-03-30

中图分类号：S852.4

文献标志码：A

文章编号：0529- 6005（2015）10- 0034- 04