miR-218在大肠癌中的表达及其临床意义

许文剑，刘　明，苏秀兰

(1.内蒙古医科大学附属人民医院普外科，呼和浩特 010020； 2.内蒙古医科大学附属医院 a.肿瘤外科, b.临床医学研究中心,呼和浩特010050)



miR-218在大肠癌中的表达及其临床意义

许文剑1，刘明2a※，苏秀兰2b

(1.内蒙古医科大学附属人民医院普外科，呼和浩特 010020； 2.内蒙古医科大学附属医院 a.肿瘤外科, b.临床医学研究中心,呼和浩特010050)

摘要：目的研究miR-218在大肠癌与正常组织中表达的差异。方法应用实时荧光定量聚合酶链反应检测60例大肠癌及相应正常组织中miR-218的表达水平，计算其相对表达量。结果60例大肠癌组织中miR-218的相对表达量为0.33±0.12，显著低于对照组， miR-218的表达差异有统计学意义(P<0.05)；miR-218在不同性别、年龄、肿瘤大体形态、组织学类型、临床分期、浸润深度、肿瘤分化程度上表达差异无统计学意义(P>0.05)，有淋巴结转移较无淋巴结转移者表达量低(P<0.05)。结论miR-218在大肠癌中呈低表达，其表达水平越低可能提示淋巴结转移越早，miR-218 可能作为抑癌基因参与肿瘤的发生、发展。

关键词:大肠癌；miR-218；实时荧光定量聚合酶链反应

大肠癌是消化道常见恶性肿瘤之一，在恶性肿瘤致死病因中排第4位[1]，其发病率呈逐年上升的趋势。肿瘤的复发、转移、扩散仍是主要的致死原因。进一步研究大肠癌的发病机制、寻找更加有效的治疗大肠癌的方法有重要意义。研究发现，微RNA(miRNA)在细胞增殖、分化、凋亡、基因调控及肿瘤的发生、发展中扮演重要角色，一些miRNA作为肿瘤抑制基因参与调解，另一些miRNA则作为癌基因发挥作用。采用基因芯片技术检测多种肿瘤组织样本中miRNA 的表达谱, 发现大多数miRNA在肿瘤样本中出现下调，少部分miRNA 表达水平上调。因此，对瘤中显著表达差异的miRNA进行生物学功能研究是有重要意义的。本研究主要分析miR-218在大肠癌中的表达及临床意义。

1资料与方法

1.1一般资料收集2011年6月至2012年6月内蒙古医科大学附属医院手术切除并经病理证实的大肠癌新鲜标本60例作为实验组，相应的正常组织标本作为对照组，正常组织均取自肿瘤边缘5 cm以上切缘阴性的无肿瘤组织。所有病例在术前均未接受化疗或放疗，并有完整的病例资料。

1.2实验方法

1.2.1RNA提取与检测标本离体后1 h内取得组织样本，迅速放入无菌无酶冻存管内并置液氮中保存。TRIzol试剂法提取总RNA，使用DU800核酸蛋白分析仪(美国BECKMAN公司)检测RNA水平，琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。

1.2.2反转录互补DNA第一链合成试剂盒、miRcute miRNA荧光定量检测试剂盒、miR-218 正向引物、反向引物(北京天根生化科技公司提供)，U6snRNA(中美泰和公司提供)。 U6正向引物： 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′； U6反向引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。反应体系：2 μg总RNA；2 μL随机引物；2 μL 高纯度 dNTP；补RNase-Free ddH2O定容至14.5 μL。70 ℃加热5 min后冷却2 min，加入以下组系：4 μL 5倍浓度的第一链合成缓冲液(含有DTT)；0.5 μL RNasin。加1 μL(200 U)TIAN script M-MLV;25 ℃温浴10 min;42 ℃温浴50 min;95 ℃加热5 min 终止反应，-20 ℃保存。

1.2.3聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)体系及条件4 ℃条件下在0.2 mL八联管中加入如下反应体系：2×miRcute miRNA Premix 5 μL；50×ROX Reference Dye 0.8 μL；miR-218正向引物0.2 μL；反向引物0.2 μL；dd H2O 3.3 μL；互补DNA 0.5 μL，总体系10 μL。PCR反应条件：94 ℃ 2 min，1个循环；94 ℃ 20 s，60 ℃ 34 s，50个循环。

1.2.4检测miR-218的相对表达量应用SYBR Green荧光定量PCR法，以U6snRNA作为内参，检测大肠癌组织和正常组织的miR-218的相对表达量。

miR-218表达水平计算方法为RQ(相对表达量)=2-ΔΔCt。ΔCt=Ct(miR-218)-Ct(U6)；ΔΔCt=ΔCt (癌组织)-ΔCt (正常组织)。ΔCt值越高表明miR-218表达越低。在荧光定量PCR技术中，Ct(CyC1ethreshold)值表示每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。

2结果

本试验中扩增曲线集中、光滑，有稳定的平台期，起峰位置位于20~30个ct值(图1，图2)，说明本次试验引物的扩增效率、特异性和模板的量都比较合适。溶解曲线集中呈单峰(图3，图4)。

图1　miR-218扩增曲线

图2　U6扩增曲线

图3　miR-218溶解曲线

图4　U6溶解曲线

在60例癌症患者中，2例miR-218的相对表达量>1, 58例<1, 其中4例<0.5。相对表达量为0.33±0.12。正常组织与癌组织的miR-218表达倍数2-ΔΔCt差异有统计学意义(t=17.32，P=0.00)。miR-218相对表达量，除淋巴结转移外，其余各因素的不同水平间，表达量差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1　miR-218相对表达量与患者临床病理特征的关系

3讨论

通过分析更多的大肠癌患者，与非肿瘤组织相比，在大肠癌组织中miR-218的表达显著下降。miR-218的低表达在结肠癌细胞系与正常结肠组织的对比中也被证实[2]。miR-218的下调也出现在其他癌症中，包括胃癌[3-4]、神经胶质瘤、鼻咽癌[5]、肺癌[6]、膀胱癌[7]。人体miR-218包含两个不同的基因(miR-218-1和miR-218-2)，它们被加工成一个相同的成熟序列的编码。miR-218-1和miR-218-2分别镶嵌于染色体4p15.2上的SLIT2基因和染色体5q35.1上的SLIT3基因中的内含子区域。4p15.1~15.3区域经常发生的缺失可导致大肠癌[8]。因此，在这个区域的杂合性缺失可能与大肠癌患者中miR-218的下调有关。另一方面，SLIT家族的宿主基因也常常在大肠癌中通过它们的启动子甲基化而被灭活[9]。有研究发现，在对大肠癌细胞系使用DNA甲基化抑制剂5-氮杂-2′-脱氧胞苷时，miR-218表达恢复；在鼻咽癌和口腔鳞状细胞癌中miR-218通过启动子的甲基化下调表达[10-11]。这些数据表明，CpG岛(双核苷酸基因组区段)的甲基化也可能会有助于miR-218在大肠癌中沉默。在大肠癌肿瘤起源阶段，下调的miR-218意味着它可能作为一个潜在的肿瘤抑制基因而发挥作用。

本研究结果显示，大肠癌组织中miR-218表达水平明显低于正常组织，提示miR-218可能在大肠癌中起抑癌基因的作用，提高miR-218的表达水平可能是一种潜在的治疗大肠癌的方法，从miR-218表达水平与大肠癌临床病理特征之间的关系可以看出，miR-218表达水平在不同性别、年龄、肿瘤大体形态、组织学类型、临床分期、浸润深度、肿瘤分化程度中差异无统计学意义，与淋巴结转移相关，有淋巴结转移的较无淋巴结转移者表达低。miR-218在大肠癌中表达水平越低可能提示淋巴结转移越早，miR-218可能作为抑癌基因参与肿瘤的发生、发展，且有望作为大肠癌诊断与预后判断的分子标志物。

参考文献

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Expression and Clinical Significance of miR-218 in Colorectal CancerXUWen-jian1,LIUMing2a,SUXiu-lan2b.(1.DepartmentofGeneralSurgery,theAffiliatedPeople′sHospitalofInnerMongoliaMedicalUniversity,Hohhot010020,China; 2a.DepartmentofSurgicalOncology, 2b.ClinicalResearchCenter,theAffiliatedHospitalofInnerMongoliaMedicalUniversity,Hohhot010050,China)

Abstract：ObjectiveTo study the expression levels of miR-218 in colorectal cancer and normal tissues.MethodsUsing real-time quantitative polymerase chain reaction to detect the expression levels of miR-218 in 60 cases of colorectal cancer and the corresponding normal tissues,and calculate its relative expression.ResultsThe relative expression of miR-218 in the tissues of 60 patients with colorectal cancer was 0.33±0.12, it was significantly lower than the control group, the difference was statistically significant (P<0.05);there was no statistically significant difference in the expression of miR-218 in the general form of gender,age,tumor histological type,clinical stage,depth of invasion,and the degree of tumor differentiation(P>0.05); there was lower expression in lymph node metastasis than in those without lymph node metastasis(P<0.05).ConclusionmiR-218 shows low expression in colorectal cancer. Its lower expression levels may indicate earlier lymph node metastasis. miR-218 may act as a tumor suppressor gene involved in tumor development.

Key words:Colorectal cancer； miRNA-218； Real time-polymerase chain reaction

收稿日期：2014-10-27修回日期：2015-01-25编辑:薛惠文

基金项目：国家自然科学基金(81160254)；内蒙古医科大学附属医院重大项目(NYFYZD2010008)

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.09.052

中图分类号:R735.35

文献标识码：A

文章编号：1006-2084(2015)09-1674-03