基于药物体系质量评价模式的白芷质量表征关联分析研究

孙雅姝　张璐　潘婷　温静　迟蕾　黄亚婷　李焕娟　孙道涵　姜艳艳　石任兵

基于药物体系质量评价模式的白芷质量表征关联分析研究

孙雅姝张璐潘婷温静迟蕾黄亚婷李焕娟孙道涵姜艳艳石任兵

【摘要】目的应用药物体系质量评价模式，对基于药物体系的白芷中各有效指标性成分进行含量测定并进行关联分析，全面表征与评价白芷质量。方法采用HPLC-PDA法对白芷中绿原酸、花椒毒酚、佛手柑内酯、欧前胡素、异欧前胡素等5种有效指标性成分的含量进行同时测定。结果基于药物体系质量评价模式，对白芷中有效指标性成分含量及其相对比值进行质量表征，同时将不同批次饮片与经过药效验证的基准批次饮片进行关联度分析。结果表明，批次2、3、13、17、21中有效指标性成分含量总体高于基准批次饮片20，批次1、5、9、11、22、24中有效指标性成分含量与批次20接近，批次5、11、1、24、9、3、13、19与批次20质量关联度较高。综合质量表征及关联分析结果，批次3、13、2、17、21、1、5、9、11、22、24质量优良度位于前列。结论基于药物体系质量评价模式，以具有确切药效的白芷饮片为基准，对白芷质量进行关联分析研究，可全面地评价白芷饮片质量，优选白芷资源。

【关键词】白芷； 绿原酸； 花椒毒酚； 佛手柑内酯； 欧前胡素； 异欧前胡素；质量评价； 关联分析

白芷为伞形科植物白芷Angelicadahurica(Fisch.ex Hoffm.)Benth.etHook.f.或杭白芷Angelicadahurica(Fisch.ex Hoffm.)Benth.etHook.var.formosana(Boiss.)ShahetYuan的干燥根，具有祛风除湿，生肌止痛，活血排脓之功效。2010版《中华人民共和国药典》(一部)中，将测定白芷中香豆素类成分欧前胡素的含量作为指标评价白芷质量[1]。目前的文献报道多着眼于白芷中的香豆素类成分[2-3]，而鲜有对白芷中酚类相关的研究报道。

本课题组在研究临床经验方白芷方抗偏头痛药物体系过程中发现，组方药味白芷中的酚类和香豆素类成分同为药物体系组成成分，与抗偏头痛药效有密切关联性[4]。基于自然药学观[5]，在对单味中药药物研究时，要注重挖掘其药物属性特性关联的药物体系及其特定组成规律，而药物体系组成成分的有效性是与其质量性有关的，即与中药药物体系组成成分的类型以及存在的量、组成比例等有关[6]。

本文以此为切入点，运用课题组所建立的基于药物体系的中药质量评价模式[7]，首次建立了同时测定白芷饮片药物体系关联组成成分：绿原酸、花椒毒酚、佛手柑内酯、欧前胡素、异欧前胡素的含量分析方法，应用有效指标性成分的含量、相对比值质量表征体系，通过“横向”和“纵向”关联分析研究[8-9]，为全面考量白芷饮片的质量，确定其优良度提供科学依据，亦为白芷有效应用奠定基础。

1仪器与试药

1.1仪器

Waters e2695高效液相色谱仪，Empower Pro软件系统，2998二极管阵列检测器；MMETTLER-AE240型电子分析天平(北京赛多利斯仪器有限公司)；KQ-500DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2试药

绿原酸(批号131201，纯度≥98%)、欧前胡素(批号130903，纯度≥98%)、异欧前胡素(批号131209，纯度≥98%)均购自成都普菲德生物技术有限公司；佛手柑内酯(批号14032211，纯度≥98%)购自成都曼思特生物科技有限公司；花椒毒酚(批号130410，纯度≥98%)购自北京北纳创联生物技术研究院；乙腈(色谱级，Fisher Scientific 公司)，甲醇(分析纯，北京化工厂)，乙酸(分析纯，北京化学试剂公司)；娃哈哈纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司)，其余试剂均为分析纯。

24批白芷饮片购自北京同仁堂药材有限责任公司，北京金象大药房及浙江、山西等省各药房，经北京中医药大学生药系刘春生教授鉴定为白芷Angelicadahurica(Fisch.ex Hoffm.)Benth.etHook.f.或杭白芷Angelicadahurica(Fisch.ex Hoffm.)Benth.etHook.var.formosana(Boiss.)ShahetYuan的干燥根，有关批次进行编号后存放在北京中医药大学中药学院中药化学系。

2方法与结果

2.1色谱条件

Thermo Hypersil GOLD(C18)液相色谱柱(250 mm×4.6 mm×5 μm)，流动相为乙腈(A)-0.1%甲酸水(B)，梯度洗脱程序为：0～3分钟，10%A；3～10分钟，10%～15%A；10～12分钟，15%～15%A；12～14分钟，15%～20%A；14～18分钟，20%～25%A；18～23分钟，25%～40%A；23～38分钟，40%～60%A；38～45分钟，60%～75%A。流速1.0 ml/分钟；柱温30℃；检测波长为320 nm、300 nm；进样量40 μL。

上述色谱条件下，5种有效指标性成分色谱峰分离度良好。其中，绿原酸在320 nm波长下有最大吸收，故选择320 nm为其检测波长；花椒毒酚、佛手柑内酯、欧前胡素与异欧前胡素均在300 nm波长下有最大吸收，故选择300 nm为其检测波长。白芷对照品及样品的HPLC色谱图见图1。

1绿原酸　2花椒毒酚　3佛手柑内酯　4欧前胡素　5异欧前胡素图1　白芷对照品及供试品的HPLC色谱图

2.2对照品溶液的制备

分别取上述5种对照品适量，精密称定，加入甲醇制成每1mL含有绿原酸11.85 μg、花椒毒酚4.44 μg、佛手柑内酯8.12 μg、欧前胡素21.0 μg、异欧前胡素13.56 μg的对照品混合溶液。

2.3供试品溶液的制备

取白芷饮片粉碎，过四号筛，称取约1.0 g，精密称定，置于100 mL具塞锥形瓶中，精密加入60%甲醇100 mL，超声提取(300 W，40 kHz)60分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足失重，过滤。超声提取2次，合并滤液，回收溶剂定容至50 mL容量瓶中，即得。

2.4线性关系考察

将“2.2”项下对照品混合溶液进样1 μL，5 μL，10 μL，15 μL,，20 μL，25 μL，30 μL，35 μL，40 μL。以进样量(μg)为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，计算回归方程及相关系数，结果见表1。

表1　5种有效指标性成分的线性回归方程和线性范围(n=9)

2.5精密度试验

取“2.3”项下同一批次白芷溶液，连续进样6次，测得绿原酸、花椒毒酚、佛手柑内酯、欧前胡素、异欧前胡素的峰面积的RSD分别为2.78%，1.69%，1.83%，1.60%，1.73%，精密度良好。

2.6重复性试验

取同一白芷饮片批次，按“2.3”项下方法平行制备供试品溶液6份，测得绿原酸、花椒毒酚、佛手柑内酯、欧前胡素、异欧前胡素的平均含量分别为0.0376%、0.0108%、0.0063%、0.0961%、0.0509%，RSD分别为2.35%，2.37%，2.45%，1.01%，1.26%，重复性良好。

2.7稳定性试验

取“2.3”项下同一供试品溶液，于室温下放置，分别于0小时，2小时，4小时，8小时，12小时，24小时进样，测得绿原酸、花椒毒酚、佛手柑内酯、欧前胡素、异欧前胡素的峰面积的RSD分别为1.90%，2.02%，1.25%，0.63%，0.60%，供试品溶液在24小时内稳定。

2.8加样回收率试验

称取同一批次白芷粉末(过四号筛)约0.5 g共6份，精密称定，加入对照品适量，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，进样，测得绿原酸、花椒毒酚、佛手柑内酯、欧前胡素、异欧前胡素的加样回收率分别为102.69%、101.87%、102.06%、101.64%、97.59%，RSD分别为2.79%、1.39%、2.65%、2.58%、0.58%，加样回收率合格，说明本方法稳定可靠，简便准确。见表2。

2.9白芷质量表征

2.9.1基于有效指标性成分含量的质量表征精密称取24批白芷饮片批次，每批平行称取3份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按照“2.1”项色谱条件进样，测定绿原酸、花椒毒酚、佛手柑内酯、欧前胡素、异欧前胡素的含量，对白芷饮片中有效指标性成分含量进行全面表征，结果见表3。

2.9.2基于有效指标性成分含量相对比值的质量表征

以佛手柑内酯的含量为基准，将24批白芷饮片中各有效指标性成分含量与佛手柑内酯含量的相对比值予以表征，结果见表4。

表2　加样回收率试验结果

表3　基于有效指标性成分含量的24批白芷饮片质量表征(mg/g，n=3)

2.10白芷质量表征关联分析

2.10.1基于与基准饮片有效指标性成分含量相对比值的质量表征的关联分析基于“2.9.1”项下表3，将经验证具有药效的基准批次饮片20的含量作为基准[4]对24批白芷饮片质量进行表征关联分析。与基准批次相比，不同批次间各有效指标性成分含量相差较大。通过计算最高比值与最低比值的比，以反映各饮片中有效指标性成分含量的差异。绿原酸含量最大相差约41.0倍，含量从高到低排序为：批次13>12>21>3>19>11>2>22>17>1>4>9>5>18>20>24>15>10>23>8>7>16>14>6；花椒毒酚含量最大相差约11.0倍，含量从高到低排序为：批次7>3>19>2>1>13>17>20>18>5>9>12>11>24>23>15>4>22>8>14>6>10>16>21；酚类成分含量和最大相差约14.5倍，含量从高到底排序为：批次13>12>3>19>21>2>11>17>1>22>9>5>18>4>20>7>24>15>23>10>8>14>16>6；佛手柑内酯含量最大相差约35.5倍，含量从高到低排序为：批次15>16>21>6>14>3>2>17>13>19>4>11>18>12>24>5>20>9>1>7>22>10>23>8；欧前胡素含量最大相差约7.2倍，含量从高到低排序为：批次15>14>6>16>2>21>3>10>17>13>9>4>19>12>11>1>22>5>24>20>23>8>18>7；异欧前胡素含量最大相差约3.8倍，含量从高到低排序为：批次15>21>6>14>10>16>17>13>4>22>11>3>1>2>20>23>8>9>18>19>24>5>12>7；香豆素类成分含量和最大相差约6.4倍，含量从高到底排序为：批次15>14>6>16>21>2>3>17>10>13>4>9>11>1>22>19>12>20>24>5>23>8>18>7。

表4　基于有效指标性成分佛手柑内酯含量相对比值的24批白芷饮片质量表征

图2　24 批白芷饮片中各有效指标性成分含量相对比值与基准批次饮片 20 对应成分含量相对比值的比值

可见，在24批白芷饮片批次中有效指标性成分含量差异性：绿原酸(41.0倍)>佛手柑内酯(35.5倍)>酚类成分含量和(14.5倍)>花椒毒酚(11.0倍)>欧前胡素(7.2倍)>香豆素类成分含量和(6.4倍)>异欧前胡素(3.8倍)，其中绿原酸含量在批次间差异最大，异欧前胡素的含量差异最小；综合考量绿原酸、花椒毒酚、佛手柑内酯、酚类成分含量和、欧前胡素、异欧前胡素和香豆素类成分含量和，批次21、2、3、17、13中有效指标性成分含量总体高于经有效性验证的批次20，批次1、5、9、11、22、24中有效指标性成分含量与批次20接近。

2.10.2基于与基准饮片有效指标性成分含量相对比值的比值质量表征的关联分析

基于“2.9.2”项下表4，以具有药效的批次20饮片为基准，将24批白芷饮片中有效指标性成分含量相对比值与基准饮片批次20的相对比值的比值进行关联分析得图2、表5。

图2中，不同颜色的矩形条代表各饮片中有效指标性成分含量相对比值与批次20对应成分含量相对比值的比值。以批次20的矩形条大小为基准，其他批次的矩形条大小与之越接近，代表该批次有效指标性成分含量比值与之越接近，表明该批次与基准批次的质量表征关联密切。由图可知，批次1、5、9、11、22、24与20质量表征关联密切。非关联系数，即以批次20为基准，其他批次与其相对比值的比值差值的绝对值之和；非关联度是非关联系数与有效指标性成分的数目的比值；进而得到关联度，以反映饮片质量之间的关联性。以批次20为基准，表征24批白芷饮片的关联度，见表5。

表5　24 批白芷饮片关联度表征

由表4可知，关联度由高到低排序为：批次20(0/100%)>5(0.5652/91.93%)>11(0.7761/88.91%)>1(1.0942/84.37%)>24(1.1501/83.57%)>9(1.1732/83.24%)>3(1.2732/81.81%)>13(1.3901/80.14%)>19(1.4002/80%)>4(1.6070/77.04%)>17(1.6283/76.74%)>18(1.6948/75.79%)>2(1.9150/72.64%)>8(2.2166/68.33%)>12(2.2869/67.33%)>23(2.4310/65.27%)>22(3.3264/52.48%)>7(3.6242/48.23%)>21(3.7441/46.51%)>14(3.9421/43.68%)>10(4.0950/41.50%)>6(4.1402/40.85%)>16(4.8213/31.12%)>15(4.8776/30.32%)，即批次5、11、1、24、9、3、13、19与基准批次20质量关联性最高，而批次6、16、15与基准批次20质量关联性相差较大。

3结论

本文基于药物体系质量评价模式，对白芷进行质量表征及关联分析研究，批次21、2、3、17、13中有效指标性成分含量总体高于批次20，批次1、5、9、11、22、24中有效指标性成分含量与批次20接近。其中批次5、11、1、24、9、3、13、19与基准批次20质量关联性最高，而批次6、16、15与基准批次20质量关联性相差较大。综合质量表征及关联分析结果，批次3、13、2、17、21、1、5、9、11、22、24质量优良度位于前列。

基于自然药学观相关理论，借助于药物体系组成成分的发现，运用相关的中药质量评价模式，对24批白芷饮片质量进行表征，发现不同批次间各指标性成分含量差异较大。以具有确切药效的批次20为基准，进行质量关联度分析比较，可以找寻到含量和相对量与基准饮片关联度最高的批次。通过上述质量表征研究，为找寻到有效质优的饮片，提供了简便有效的筛选途径，同时揭示有效成分含量与相对比值在提升药物质量方面的重要性，为优选中药药物原料提供了新颖的思路和方法学借鉴。

参考文献

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(本文编辑：董历华)

·启事·

《环球中医药》杂志2015年征稿启事

《环球中医药》杂志(CN 11-5652/R，ISSN 1674-1749)由国家卫生和计划生育委员会主管，中华国际医学交流基金会主办。本刊为中国科技核心期刊，美国《化学文摘》收录期刊，张伯礼院士担任总编辑。

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·基于药物体系导向研究专题·

作者单位：100102北京中医药大学中药学院国家中医药管理局中药经典名方有效物质发现重点实验室[(张璐(硕士研究生)、李焕娟(硕士研究生)、朱乃亮(博士研究生)、彭平(博士研究生)、孙道涵(硕士研究生)、孙雅姝(硕士研究生)、迟蕾(硕士研究生)、姜艳艳、石任兵]；北京市教委中药质量控制技术工程中心(姜艳艳、石任兵)

Quality characterization and correlation analysis ofBaizhi(AngelicaDahurica) based on a new quality evaluation model of drug systemSUNYa-shu，ZHANGLu，PANTing，etal.KeyUnitofExploringEffectiveSubstancesofClassicalandFamousFormulasofStateAdministrationofTraditionalChineseMedicine，SchoolofChinesePharmacy，BeijingUniversityofChineseMedicine，Beijing100102，China

【Abstract】ObjectiveBased on quality evaluation model of drug system, to determine the content and analyze correlation of effective index components in drug system of Baizhi(Angelica dahurica), for the comprehensive quality of characterization and evaluation of angelica dahurica. Methods Use HPLC-PDA method for simultaneous determination of 5 effective index components in twenty-four numbers of Baizhi(Angelica dahurica), including Chlorogenic acid, Xanthotol, Bergapten, Imperatorin and Isoimperatorin. Results Based on quality characterization model of drug system, to represent quality based on the content and the content relative ratio of effective index components and analyze correlation between the reference which its therapeutic effect has been identified and other samples. The result shows the total content of effective index components in No.2, No.3, No.13, No.17 and No.21 are higher than No.20, and No.1, No.5, No.9, No.11, No.22 and No.24 are closer to No.20. Compared with No.20, the correlation degree of quality representation of No.5, No.11, No.1, No.24, No.9, No.3, No.13, No.19 is higher. Consolidated quality characterization and correlation analysis, the quality of No.3, No.13, No.2, No.17, No.21, No.1, No.5, No.9, No.11, No.22 and No.24 are excellent. Conclusion Using quality evaluation model based on drug system, and with the exact therapeutic effect Angelica dahurica slices as a benchmark, for correlation analysis of quality research of Angelica dahurica which can comprehensively evaluate the quality of Angelica dahurica yinpian, providing the basis for looking for resources of Angelica dahurica .

【Key words】Angelica dahurica； Chlorogenic acid； Xanthotol； Bergapten； Imperatorin； Isoimperatorin； quality evaluation； correlation analysis

通讯作者：石任兵(1957- )，博士，教授，博士生导师。研究方向：中药(复方)有效物质基础研究与药物创新。E-mail：shirb@126.com

作者简介：张璐(1990- )，女，2012级在读硕士研究生。研究方向：中药(复方)有效物质基础研究与药物创新。E-mail：zhanglu8070@126.com

基金项目：国家“十二五”科技支撑计划(2012BAI29B06)；北京中医药大学科研创新团队资助项目(2011-CXTD-12)；北京中医药大学重点学科开放课题(2013-2DXKKF-23)

(收稿日期：2014-09-20)

Corresponding author：SHI Ren-bing，E-mail:shirb@126.com

【中图分类号】R284.1

【文献标识码】A

doi:10.3969/j.issn.1674-1749.2015.03.003