DNA甲基化检测技术进展及经验总结

李　懿,李光润(综述)，陈　宏(审校)

(成都军区昆明总医院肿瘤科,昆明 650032 )



DNA甲基化检测技术进展及经验总结

李懿,李光润(综述)，陈宏※(审校)

(成都军区昆明总医院肿瘤科,昆明 650032 )

摘要：DNA甲基化作为一种表观遗传学元件，参与正常细胞的发育分化、基因组印记、X染色体失活和染色质重构等生命过程，在肿瘤演进中亦发挥重要作用。为满足不断深入的研究需求，DNA甲基化检测技术得到了较快的发展，检测的灵敏度和特异度不断提高，并逐步从个别位点向高通量检测发展。该文综述了目前常用的DNA甲基化分析方法，并简要总结了其在应用中的关键点和经验。

关键词：表观遗传学；DNA甲基化；检测

DNA甲基化是表观遗传学修饰的主要形式，甲基化模式的异常促进细胞恶性转化，参与肿瘤演进[1-2]。许多基因具有肿瘤特异性的甲基化表型[3]，一方面基因组广泛的低甲基化引起原癌基因活化，基因组不稳定性增加[4]；另一方面启动子区的高甲基化，引起抑癌基因及错配修复基因表达沉默，导致肿瘤的发生[5]。研究表明，基因组的低甲基化随着细胞恶性度的增加而愈加明显，是病情诊断的重要指标[6]；此外，CpG岛局部的高甲基化发生于细胞恶变之前，能在早期预测肿瘤的发生[7]，其也能有效地预测肿瘤的复发和转移[8]，在肿瘤的鉴别诊断中亦发挥重要作用[9]。因此，检测肿瘤发生中相关基因的甲基化模式具有重要意义，现就近年来中外文献报道的甲基化检测方法进行简要的分析总结。

1酶切-Southern杂交技术

酶切-Southern杂交是早期用于甲基化研究的技术，其依赖于同裂酶(HpaⅡ和MspⅠ)识别位点中甲基胞嘧啶的敏感度不同，与基因组DNA共同消化后，与32P标记的检测基因片段的探针行Southern杂交，根据片段长度分辨位点的甲基化情况。该方法简单且实验结果易解释，可进行基因CpG岛总体甲基化模式的定量研究，但样品需要量大且仅提供位于甲基化敏感限制性内切酶识别序列中的CpG甲基化信息，易出现由不完全酶切引起的假阳性。

2亚硫酸氢钠修饰后测序法

亚硫酸氢钠修饰后测序法是一种对DNA进行亚硫酸氢钠处理、聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增与DNA测序相结合的方法，能够提供测定区域的序列信息，准确定位甲基化胞嘧啶位点；重亚硫酸盐修饰后，甲基化胞嘧啶保持不变，但非甲基化胞嘧啶转变为尿嘧啶，PCR扩增后为胸腺嘧啶，其将甲基化状态的差异转化成碱基的差异，从而对胞嘧啶的甲基化状态进行分析；但在亚硫酸钠处理的酸性环境下，单链特异性PCR模板稳定性下降，容易降解；并且模板链CG二核苷酸水平高易形成复杂的二级结构，常出现非特异性条带，结合“巢式PCR法”能显著提高扩增的特异度[10]。在运用亚硫酸氢钠修饰后测序法中要注意如下5个方面。①DNA的质量控制：DNA模板纯度要求高，含量约2 μg，否则在亚硫酸盐处理时会因DNA模板太多致使DNA处理不完全进而导致PCR扩增失败，如果DNA模板太少会导致假阴性。②修饰时的温度控制：温度过低或过高都会导致DNA模板处理失败，所用试剂一定要现用现配，严格按试剂盒说明书进行，保证试剂的pH值为8.0，否则会降低修饰效率，修饰后的模板应保存在-20 ℃，不应超过2个月。③引物的合理设计：在亚硫酸氢钠修饰后测序法中引物设计是关键，引物设计时应遵循如下原则：a.主要针对编码链设计引物，以修饰后的DNA序列作为模板；b.选择CpG岛作为PCR扩增的靶区域；c.引物根据不含CpG位点的序列来设计,但扩增区域中应包括尽可能多的CpG位点。④退火温度的控制：在PCR反应中，CG含量高的退火温度值高，非甲基化引物中正义引物不含C，反义引物不含G。⑤反应增强剂：当CG含量高于70%或模板中有二级结构时可考虑添加增强剂，从而减低G+C富集区的熔点及解链温度、提高扩增效率，并增加Taq DNA连接酶的稳定性，防止其因温度升高而变性。但一定要注意它们的浓度范围(二甲基亚砜 1%～10%，甘油5%～20%)，超过一定浓度对酶有抑制作用，反而使扩增效率降低。

3甲基化特异性PCR

MS-PCR以亚硫酸钠修饰的甲基化依赖的单核苷酸多态性为基础，设计能区分基因组甲基化状态的引物，识别亚硫酸钠修饰的甲基化和非甲基化等位基因的序列差异，同时也识别没有修饰DNA和不完全修饰DNA的序列差异，通常选择胞嘧啶含量高的序列设计引物，引物的3′端邻近检测的CpG二核苷酸，引物覆盖序列中CpG岛所占比例越高，甲基化DNA检出率越高。该方法简单、省时、敏感，还可用于石蜡包埋样品甲基化分析，能检测出样品中0.1%的甲基化DNA含量[11]。为提高甲基化的检出率，对甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR, MS-PCR)进行改进后设计出半巢式PCR和巢式PCR。其中，半巢式PCR是指用甲基化引物MS、M2A和非甲基化引物US、U2A分别进行甲基化和非甲基化的特异性扩增；然后在MS和M2A之间增加一条引物M1A，再以MS、M1A进行第二轮甲基化特异性扩增，同样的用US、U1A作第二轮的非甲基化扩增。而巢式PCR是指用非特异性的外侧引物对处理后的样品进行扩增，然后再用特异性的内侧甲基化引物和非甲基化引物做第二轮扩增。用MS-PCR扩增后，可能会出现如下3种可能的结果：①产物电泳为阴性(无目的基因带出现)；②产物电泳出现多条非特异带(包括目的基因)；③产物电泳为阳性(只有目的基因带)。出现①和②结果时，在保证反应体系和引物没有问题的情况下可通过调整MS-PCR的反应温度而得到目的基因带。按图1所示的方法，根据电泳结果调整退火温度[12]。

a:产物电泳为阴性(无目的基因带出现)；b:扩增出特异的目的条带；c:产物电泳出现多条非特异带(包括目的基因)；当出现a和c的情况时，按图中所示调整退火温度；↑表示升高退火温度；↓表示降低退火温度图1　甲基化特异性聚合酶链反应电泳结果

4结合亚硫酸盐处理的限制酶解分析法

该技术通过限制性酶切反应揭示亚硫酸钠处理、PCR扩增后引入的甲基化依赖的单核苷酸多态性。Xiong和Laird[13]阐述了结合亚硫酸盐处理的限制酶解分析法的基本步骤，用限制性内切酶BstUI识别2个CG二核苷酸均发生甲基化的序列(5mCG5mCG)，用限制性内切酶TaqI仅识别1个CG二核苷酸的甲基化，进行限制性切割后，能准确定量样本的甲基化比例。该方法操作简单，能准确定量，可分析微切割的石蜡包埋样品，避免了Southern杂交定量时由甲基敏感性酶产生的假阳性；但其局限性在于只能获得特殊酶切位点的甲基化情况，不能除外假阴性检测的可能性。用亚硫酸氢钠联合限制性内切酶分析法进行甲基化检测时应注意：①引物的设计与MS-PCR不同，亚硫酸氢钠联合限制性内切酶分析法的引物不能含有CpG双核苷酸序列；而MS-PCR要有分别针对甲基化和非甲基化的引物，引物中保证有3个以上的CpG双核苷酸序列。②亚硫酸钠处理的质量要求高，可通过设立限制性内切酶Hsp9211酶切内对照确保亚硫酸钠修饰完全。③所有的酶切反应在适宜温度下至少进行4 h[14]。

5差异甲基化位点扫描

该方法利用低熔点琼脂糖对基因组DNA的保护作用，使DNA免受物理性损伤，避免DNA分散，使得从少量的细胞(10个细胞/反应)中既可获取大量DNA进行甲基化检测，同时在琼脂糖中进行限制性酶切后，用重复序列引物或随机引物进行第一轮PCR扩增，利用甲基化和非甲基化模板扩增产物的片段差异，进行第二轮任意引物的扩增，根据变性电泳后扩增条带的亮度反映模板的甲基化程度[15]。该方法对样品的需要量非常少，能有效地避免大量样品间由于细胞异质性引起的差异，结果可信度高，其使单细胞甲基化分析成为可能。

6甲基化荧光检测法

该方法是在MSP技术的基础上，结合荧光实时PCR的甲基化定量分析方法。经亚硫酸钠处理后，需要用双标记的荧光探针进行扩增，当探针与靶序列完全匹配时，可被具有核酸外切酶活性的Taq DNA多聚酶切割，释放5′端报告基因，远离3′端荧光淬灭基团的屏蔽，使得5′端荧光染料受激发所发射的荧光信号可被探头检测，荧光信号的大小与扩增产物的量成比例[16]。其中，锁式探针作为近来常用的一种探针形式，其原理是在完全匹配的前提下，线性锁式探针被有效地连接成环形，并可以在后续的PCR反应中进行扩增；而没有配对的序列时，探针只能以线性的形式存在，在核酸外切酶作用下，线性探针被消化水解而不能进行PCR扩增[17]。该方法避免了上述检测技术中PCR扩增后进行凝胶电泳及限制性酶切的常规操作，在一定程度上提高了检测的敏感度及特异度，常用于临床标本的分析。但由于检测探针的价格较高，且需要依赖昂贵的定量PCR仪，所以检测的成本较高。

7甲基化特异性寡核苷酸微阵列

依据基因组范围内分析基因突变和单核苷酸多肽性的微阵列杂交技术原理，发展了甲基化特异性寡核苷酸微阵列，利用模板中甲基化状态的差异经PCR反应后扩增出不同的核苷酸序列，与微阵列上的能区分特异胞嘧啶位点甲基化状态的寡核苷酸探针杂交，高通量同步定量分析全基因组的甲基化模式[18]。Gitan等[19]的研究发现，部分甲基化特异性核寡苷酸微阵列检测为0甲基化的样品能被MSP的甲基化引物扩增出了一条微弱的条带，提示杂交背景的信号影响了其对CpG岛低甲基化水平的检测，可通过调整杂交条件和洗片条件来减少假阳性结果。此方法的关键是寡核苷酸探针，设计时应注意：①针对2个或多个CpG位点的探针，能显著减少交叉反应，但应避免连续超过4个胸腺嘧啶残基或鸟嘌呤残基；②重叠2个以上的CpG位点，则探针应包括每个位点甲基化和非甲基化胞嘧啶的所有组合；③实验中应设立明确的对照系统测试寡核苷酸探针的有效性。该方法能形成癌症遗传图谱，具有良好的应用前景[20]。

8变性高效液相层析

将亚硫酸钠修饰后的DNA分解为单核苷酸后，依据5种核苷酸在极性溶液中的溶解度不同，其在色谱柱中的保留时间存在差异，溶解度高的随极性溶液先过滤出，而溶解度低的则在柱中的停留时间较长，各核苷酸的出柱顺序是：dCp、5′mdCp、Tp、dGp和dAp,从而了解样品全基因组水平的甲基化程度，但该方法的局限性在于不能了解特定基因的甲基化的位置和状态，并且对样品DNA的纯度要求高，不能有RNA的污染[21]。

9甲基化DNA免疫共沉淀

利用5-甲基胞嘧啶特异性抗体或含有甲基结合结构域的蛋白，通过免疫沉淀作用于特异性的富集基因组中的甲基化或非甲基化片段。其基本程序是：将基因组DNA打断为400～500 bp的片段，经加热变性后将样品分为2份，其中1份作为Total input DNA 样品，而另1份加入甲基化DNA特异性抗体，使用亲和层析分离上述样品中的甲基化DNA片段抗体复合物，而洗脱其中的非甲基化片段，纯化得到的甲基化DNA可以结合荧光定量PCR技术或芯片技术检测基因的甲基化[22]。该方法特异度高，精确性好，避免了探针合成，但是对低CpG密度区域的甲基化分析存在问题。

10结语

甲基化检测技术的不断进步，为揭示疾病中基因表达沉默的表观遗传机制提供了有效的手段，从而能够高通量地分析多个基因多个CpG位点的甲基化模式，并从总体动态的角度了解疾病相关的甲基化信息。通过介绍近几年来DNA甲基化检测的新方法，总结了各方法在应用中的经验和注意事项希望能对DNA甲基化的研究者有所帮助。同时也期待着甲基化技术的不断进步，检测的敏感度和特异度不断提高，以满足临床检测的要求，使其临床的应用范围更加广泛，能更好地指导临床的个体化诊疗。

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Progresses and Experiences of DNA Methylation Detection TechniquesLIYi,LIGuang-run,CHENHong.(DepartmentofOncology,KunmingGeneralHospitalofChengduMilitaryCommand,Kunming650032,China)

Abstract:DNA methylation,as an epigenetic component,is involved in the processes of cell development,differentiation,genomic imprinting,X chromosome inactivation and chromatin remodeling,and plays an important role in carcinogenesis as well.The DNA methylation analysis technology has been developing rapidly due to the needs of deeper research:analyses that previously were restricted to specific loci can now be performed on a high throughput,meanwhile the sensitivity and specificity have made great of improvements as well.Here is to make a review of the methods to detect DNA methylation and summarize the key points and experiences in application.

Key words:Epigenetic; DNA methylation; Detection

收稿日期：2014-02-27修回日期：2014-06-23编辑：郑雪

基金项目：国家自然科学基金(81201756)；云南省自然科学基金(2012FD091)

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.02.005

中图分类号：Q3-3； Q751

文献标识码：A

文章编号：1006-2084(2015)02-0204-04