蜗牛酶促毛蕊异黄酮苷转化成毛蕊异黄酮的条件研究*

张亚洲，王 涛，宋 强，邹树良，朱金秋，刘海林

（1.贵州理工学院，贵州 贵阳 550003；2.广西壮族自治区药用植物园，广西南宁 530000；3.西藏格创制药有限公司，西藏拉萨 850000）

蜗牛酶促毛蕊异黄酮苷转化成毛蕊异黄酮的条件研究*

张亚洲1，2，王 涛1，宋 强3，邹树良1，朱金秋1，刘海林1

（1.贵州理工学院，贵州 贵阳 550003；2.广西壮族自治区药用植物园，广西南宁 530000；3.西藏格创制药有限公司，西藏拉萨 850000）

目的探讨蜗牛酶酶解毛蕊异黄酮苷转化生成毛蕊异黄酮的最佳转化条件和方法。方法采用恒温摇床，将蜗牛酶溶于合适温度的水中，加入用DMSO溶解的苷，边加边搅拌，加完后反应30 min，最后用乙腈终止反应。通过反复重结晶得到所需要的苷元。结果最佳转化条件为，当蜗牛酶与毛蕊异黄酮苷的比例为1∶2时，加入200 mL的保温35～37℃水中，待蜗牛酶溶解均匀后，再加入毛蕊异黄酮苷（溶于1 mL的DMSO中），pH维持5～8，孵化0.5 h后，用乙腈等量终止反应。结论该法能有效使毛蕊异黄酮苷转化为纯度大于98%的毛蕊异黄酮，方法简单，易于操作。

蜗牛酶；毛蕊异黄酮苷；毛蕊异黄酮；转化

毛蕊异黄酮是来源于蒙古黄芪 Astragalus membranaceus (Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao中有雌激素样作用的异黄酮类活性化合物，在其中含量最高，也一直是药学研究的热点[1]。蜗牛酶是从蜗牛的嗦囊和消化道中提取物制备的混合酶[2-4]，含有纤维素酶、果胶酶、淀粉酶、蛋白酶等20多种，是一种 β-D-葡萄糖水解酶，能有效水解 β-D-葡萄糖结合的糖苷，从而制备糖上连接的相应苷元[5-6]。笔者对蜗牛酶水解毛蕊异黄酮苷去掉7位葡萄糖后制备毛蕊异黄酮的方法进行了研究，现报道如下。

1 仪器与试药

DIONEX ultimate 3000型高效液相色谱仪；恒温水浴锅（江苏常州顺华仪器设备有限公司）。水为纯水；乙腈（天津市西华特种试剂厂，批号为20120911）均为分析纯，甲醇（天津市西华特种试剂厂，批号为20120911），蜗牛酶（上海源叶生物技术有限公司）。毛蕊异黄酮苷、毛蕊异黄酮(四川维克奇试剂有限公司，批号分别为20100327，20100523)含量均大于99.5%。

2 方法与结果

2.1 含量测定条件

色谱柱：菲罗门C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；检测波长：254 nm；流速：1.0 mL/min；流动相[7-8]：乙腈-水(25∶75)。2.2 转化条件优选

孵化溶液与用量：称取200 mg的蜗牛酶，分别加入100，200， 300 mL的保温（37±0.2）℃水中，溶解均匀后，再加入毛蕊异黄酮苷200 mg（溶于1 mL的DMSO中），孵化1 h后，用乙腈等量终止反应。超声后摇匀后取样，微孔滤膜过滤，20 μL进样，记录色谱图，见图1，结果见表1。结果加入的水量没有较明显的影响。

图1 高效液相色谱图

孵化中蜗牛酶与毛蕊异黄酮的用量比例：称取200 mg的蜗牛酶，分别加入200 mL的保温（37±0.2）℃水中，溶解均匀后，再分别加入毛蕊异黄酮苷 200，300，400，500 mg（溶于 1 mL的DMSO中），孵化1 h后，用乙腈等量终止反应。超声后摇匀后取样，微孔滤膜过滤，20 μL进样，记录色谱图，结果见表2。当酶与毛蕊异黄酮苷比例(酶∶药)小于2时，转化率（A/mg）相差不大(RSD=0.25%)。

表1 蜗牛酶在不同体积的水中转化情况

表2 不同比例的毛蕊异黄酮苷和蜗牛酶的转化情况

孵化时间：称取200 mg的蜗牛酶，分别加入200 mL的保温（37±0.2）℃水中，溶解均匀后，再分别加入毛蕊异黄酮苷200 mg（溶于1 mL的DMSO中），孵化0.5，1，1.5 h后，用乙腈等量终止反应。超声后摇匀后取样，微孔滤膜过滤，20 μL进样，记录色谱图，结果见表3。孵化时间在30 min后2 h内转化率没有差异。

表3 不同孵化时间毛蕊异黄酮苷的转化情况

孵化时温度：称取200 mg的蜗牛酶，分别加入200 mL的保温(35±0.2)℃、(37±0.2)℃、(39±0.2)℃水中，溶解均匀后，再分别加入毛蕊异黄酮苷200 mg（溶于1 mL的DMSO中），孵化0.5 h后，用乙腈等量终止反应。超声后摇匀后取样，微孔滤膜过滤，20 μL进样，记录色谱图，结果见表4。孵化时温度35～37℃时的转化效果较好。

表4 不同孵化温度对毛蕊异黄酮苷的转化情况

孵化时pH：称取200 mg的蜗牛酶，分别加入200 mL的保温(37±0.2)℃水中，溶解均匀后，再分别加入毛蕊异黄酮苷200 mg（溶于1 mL的DMSO中），设立孵化时 pH为5.0，6.0，7.0，8.0，孵化0.5 h后，用乙腈等量终止反应。超声后摇匀后取样，微孔滤膜过滤，20 μL进样，记录色谱图，结果见表5。孵化时pH在5～8时的转化效果较好。

表5 不同孵化时pH对毛蕊异黄酮苷的转化情况

酶解终止溶剂：称取200 mg的蜗牛酶，分别加入200 mL的保温(37±0.2)℃水中，溶解均匀后，再分别加入毛蕊异黄酮苷200 mg（溶于1 mL的DMSO中），孵化0.5 h后，分别用乙腈、甲醇、乙酸乙酯等量终止反应。超声后摇匀后取样，微孔滤膜过滤，20 μL进样，结果见表6。不同孵化的终止溶剂甲醇与乙腈对毛蕊异黄酮苷转化情况的影响较小。

表6 不同孵化的终止剂对毛蕊异黄酮苷的转化情况

2.3 酶解反应条件确定

综合以上试验结果，用蜗牛酶水解毛蕊异黄酮苷得到毛蕊异黄酮时，称取 1份蜗牛酶，分别加入 100倍的保温35～37℃水中，待蜗牛酶溶解均匀后，再分别加入的毛蕊异黄酮苷（2倍量蜗牛酶以下，溶于1 mL的 DMSO中），pH维持在5～8，孵化0.5 h后，用乙腈等量终止反应，结果见表7。3次试验中转化率均大于98%，结果较稳定（RSD=0.14%），均达到了要求，可以用来制备高纯度的毛蕊异黄酮（含量＞98%）。

表7 3次不同试验中毛蕊异黄酮苷的转化情况

3 讨论

自然界植物中所含苷以β-D-葡萄糖苷形成的苷元为主，β-D-葡萄糖苷占植物中分离所得苷的90%以上，新鲜植物中苷的含量一般大于对应的苷元[9]。由于苷在口服后均经肠道细菌转化为苷元而吸收，故在进行研究时一般多采用苷元[10]。

蜗牛酶是一种具有专属性的β-D-葡萄糖苷转化酶。蜗牛酶酶解反应系统简单，对环境不产生污染，转化体系中的水用纯净水或自来水的影响较小；再者，酶解反应具有专属性强、反应迅速、要求简单、经济、实惠等优点，可成为工业中应用的一个理想选择[2，4]。本试验结果显示，转化时 pH在5～7时转化效果较好；温度控制在35～37℃时孵化，转化效果较好；转化速度较快，均可在30 min后既可达到平衡。本研究为水解β-D-葡萄糖苷提供了方法和借鉴，方法与设备简单，且易操作，是一种进行相关转化的实用、可行的优良方法。

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Calycosin-7-O-β-D-Glucoside Transformation into Calycosin by Incubation with the Snailase

Zhang Yazhou1,2，Wang Tao1，Song Qiang3,Zou Shuliang1，Zhu Jinqiu1,Liu Hailin1
(1 Guizhou Institute of Technology,Guiyang,Guizhou,China 550003; 2 Guangxi Medicinal Botanical Garden,Nanning,Guangxi,China 530000; 3.Xizang Gechuang Pharmaceutical Co.,Ltd.,Lasa,Xizang,China 850000)

Objective To study the best best conditions and methods to conduct the transformation of calycosin-7-O-β-D-glucoside into calycosin using the enzymatic hydrolysis with snailase.M ethods The snailase was dissolved in a suitable water in constant temperature shaking table and then added dimethyl sulfoxide(DMSO)which calycosin-7-O-β-D-glucoside was dissolved in,kept the reaction for 30 min,and finally terminated the reaction with acetonitrile.Results When the snailase and calycosin-7-O-β-D-glucoside were in the ratio of 1∶2,added with 200 mL water(keeping in 35-37℃),added calycosin-7-O-β-D-glucoside that was dissolved in 1 mL of DMSO,and the pH was maintained at between 5-8,then quenched with an equal amount of acetonitrile after incubating 0.5 h.Conclusion This method can easily transform the calycosin-7-O-β-D-glucose into calycosin(＞98%),and the operating process is simple and effective.

snailase;calycosin-7-O-β-D-glucoside;calycosin

R284；R282.71

A

1006-4931(2015)19-0021-03

张亚洲（1980-），男，博士研究生，副教授，研究方向为天然药物的活性成分发现和代谢研究，(电话)0851-88210721（电子信箱）zhangyazhou＠git.edu.cn。

2015-04-09)

*广西自然科学基金（黄芪皂苷Ⅳ，Ⅱ及其苷元环黄芪醇的代谢研究），项目编号：2013GXNSFBAO19187；贵州理工学院项目（山豆根中的主要有效物质基础的体内有效物质形式研究)，项目编号：XJGC20141106。