基于口腔黏膜脱落细胞的CYP2C91075A/C 多态性流行病学研究

王 伟，童小文

(上海交大医学院附属第九人民医院 急诊科，上海，200011)

华法林(Warfarin)是一种香豆素衍生物，主要是通过抑制细胞内维生素K 环氧化还原酶的活性，阻止了Vit K 的循环利用，同时使得Vit K依赖性的凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ不能被有效激活，进而起到抗凝作用，是目前神经内科和心内科等临床广泛使用的一种口服抗凝药物。其中S-华法林(左旋华法林)是临床使用的消旋华法林的主要成分，目前也是人类对华法林的药物代谢研究也集中于此型［1］。华法林主要经细胞色素P4502C9(Cytochrome P450，CYP 2C9)代谢，在亚州和中国汉族人中主要以CYP 2C91075A＞C 突变最为多见。临床［2－5］发现CYP 2C91075A＞C多态性突变与个体间华法林剂量差异化密切相关。因此明确CYP 2C91075A＞C 多态性突变对指导临床用药有非常重要的意义，本研究旨在进一步探明CYP 2C91075A＞C 多态性在中国人群中的分布情况，为华法林药物在临床中合理规范使用提供依据。

1 材料与方法

1.1 病例来源

上海交大医学院附属第九人民医院急诊科门诊及病房中随机选择需常规口服华法林药物的江西汉族患者680例，其中男370例，女310例，年龄在40～68岁，平均57岁，所有入选患者签知情同意书后纳入研究。

1.2 主要实验仪器及试剂

Rotor-Gene 6000 荧光PCR 仪(Corbett Life Science 公司，美国)，ABI 3730 xl 测序仪(ABI 公司，美国)，高保真PCR MIX(凡济，上海)，DNA Marker 及口拭子DNA 提取试剂盒(凡济，上海)，口拭子采样拭子(凡济，上海)。

1.3 样本采集及DNA 提取

所有入选患者清水漱口后，用口拭子采样拭子在两颊内侧分别上下刮取15 次，采样后置于试剂盒保存液后室温保存，3 个月内按照凡济公司口拭子核酸抽提试剂盒说明书进行DNA 提取，用紫外分光光度计对所提取的DNA 进行定量和纯度检测，－20 ℃冰箱保存备用。

1.4 CYP 2C91075A＞C 突变检测

1.4.1 PCR 引物设计与合成:F:序列5'-TGCACGAGGTCCAGAGATGC-3，产物长度131 bp;R:序列5'-AAACATGGAGTTGCAGTGTAG-3。

1.4.2 PCR 反应体系:每个0.2 mL eppendorf 管中依次加入以下反应液:2.5 μL 模板，10 μL 5×PCR 缓冲液(100 mmol/L Tris-HCl，pH 8.3，250 mmol/L KCl，50 mmol/L MgCl 25 mmol/L EDTA，5 mmol/L NAD+，0.5%(v/v)Triton X－100)，1 μL 热启动酶，5 μL 引物混合液(每条引物浓度 为1 μL mol/ L)，5 μL 10 × Eva Green，26.5 μL 去离子水，总反应体系为50 μL。混合后在Rotor-gene 6000 定量PCR 仪进行扩增，反应条件为:95 ℃预变性5 min，95 ℃变性20 s，54 ℃30 s，72 ℃30 s，共30 个循环。

1.4.3 限制性内切酶消化及电泳分型检测:PCR 反应结束后经2% 琼脂糖凝胶电泳，Gold View 核酸染料染色检测得到预期大小的片断后，再进行下一步酶切反应;酶切反应体系30 μL，含PCR 产物10 μL，限制性内切酶1.5 μL，10X 酶切缓冲液3 μL，混匀后置37 度消化4 h，用4%琼脂糖凝胶电泳，Gold View 核酸染料染色后分析结果。

酶切结果判定:根据引物设计，PCR 产物大小应为131 bp，如为野生型，则被切为110 bp 和21 bp 两段，但由于21 bp 片段较小，在琼脂糖检测时难以显示，所在当采检个体为野生型时纯合子显示110 bp 一条带，如为突变纯合子则只显示131 bp 一条带，杂合子则可显示110 bp 和131 bp两条带。

1.5 数据分析

用SPSS 13.0 软件分析CYP 2C91075A＞C基因型及等位基因频率分布情况。

2 结果

CYP2C9 基因只有AA(610例)和AC(70例)两种基因型被发现，未见CC 型，分布频率分别为89.71% 和10.29%，等位基 因A 的频率 为94.85%，等位基因C 的频率为5.15%。PCRRFLP 检测结果示意图见图1。

图1 PCR-RFLP 检测结果示意图

3 讨论

近年来药物遗传学研究进展迅速，人们已经越来越认识到药物代谢的种族及个体差异性与药物代谢相关基因的多态性关系密切。其中CYP2C9 作为细胞色素P450 酶家族中的重要成员，是肝微粒体中重要的药物代谢相关酶，大量研究［3－5］表明CYP2C9 基因具有遗传多态性。目前研究最多的有三种基因型，分别是野生型CYP2C9* 1，突变型CYP2C9* 2(430C＞T)和突变型CYP2C9* 3(1075A＞C)。近年来研究［3］表明，CYP2C9 多态性频率存在明显的人种差异性，总体来说白种人较黄种人和黑种人存在更高的突变率，且有些突变类型只存在于某个或某几个人群中，在白种人和土耳其人群中2/3 的个体为野生型纯合子，1/3 个体是* 2 或* 3 的杂合子，小于2.5%的个体是* 2* 2，* 2* 3 或* 3* 3 基因型的携带者;而在美国黑人和东亚人群中未发现CYP2C9* 2 等位基因［6］;在国内除在新疆维吾尔族中检测到CYP2C9* 2 等位基因(频率为3%)以外，其他研究［7］中均未发现CYP2C9* 2的等位基因，因此本研究重点针对CYP2C9* 3 即1075A/C 进行检测，入选病例中未发现1075A＞C纯合突变体，只检出1075A 与C 杂合突变的患者70例，等位基因频率为10.92%，略高于之前耿启彬等2012年报道的广东地区的7.9%［8］，但低于何震宇2006年报道的心脏瓣膜置换术后长期服用华法林病人的18.18%，这与之前得到的CYP2C9 突变存在人种差异的结论是一致的。

从口腔颊黏膜脱落细胞中获取DNA 并进行基因检测有许多的优势:①无创性，可有效避免采血的痛苦，便于对小孩、老人或某此抗拒取血，如某些精神疾病患者等进行基因样本的采集;②简便易行，只需口拭子和离心管即可;③可提供足量的DNA，即往报道的实验中单拭子得率可达0.5～5 μg，本实验中所采用的凡济生物改进后的单拭子得率可达5～15 μg［9］，可满足基本上所有后续的基因学检测;④可以较长时间的保存，加上保存液后可室温放置3 个月仍能提取出完整的基因组。因此通过口拭子刮取口腔颊黏膜脱落细胞这种非侵入性方法来获得DNA，能最大限度的减少被检者的痛苦［10－11］。当然，口拭子刮取口腔颊黏膜脱落细胞所得的DNA 不可避免的会有可能混有食物或是口腔内细菌的污染，这些外来DNA 如果与所检测基因有重叠或相似序列时，则可能会干扰检测结果，随着目前基因检测技术敏感性和特异性的不断提高，通过优化引物可很好的解决外来DNA 的干扰问题。

本研究表明CYP2C91075A/C 等位基因在中国人群中有比较高的分布频率，由于之前研究已经表明携带有该突变的个体服用华法林时更易出现药物毒副作用，因此临床上在使用华法林药物时应进行CYP2C9 基因分型检测，有利于指导临床合理使用华法林药物，降低毒副作用的发生，对临床个性化用药具有一定的指导作用，而基于口腔黏膜脱落细胞这一无创采样方式将有利于该项检查的大范围推广实施。

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［6］Limdi N A，Arnett D K，Goldstein J A，et al.Influence of CYP2C9 and VKORC1 on warfarin dose，anticoagulation attainment and maintenance among European-Americans and African-Americans［J］.Pharmacogenomics，2008，9(5):511.

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［9］韩跃峰，李磊，王晓雯，等.口腔黏膜拭子在遗传性耳聋常见致病基因检测中的应用研究［J］.解剖与临床，2012，(05)，381.

［10］徐玉乐，周海英，徐军，等.从口腔黏膜拭子提取基因组DNA 进行年龄相关性黄斑变性易感基因的检测［J］.中华眼科杂志，2012，48(2):114.

［11］董睿，刘毅，赵冬梅，等.颊黏膜拭子检测孤独症谱系障碍儿童相关基因多态性的临床应用［J］.中国神经精神疾病杂志，2014，40(7):424.