外源性导入肝细胞生长因子对人肺腺癌A549 细胞增殖、黏附、移动和侵袭的影响

高 霞，李 恒，韩 笑，陈洪雷

(1.湖北省中西医结合医院 病理科，湖北 武汉，430015;2.湖北省妇幼保健院 小儿心血管内科，湖北 武汉，430070;3.武汉大学基础医学院 病理学教研室，湖北 武汉 430071)

肺癌是严重威胁人类健康和生命的恶性肿瘤之一，这其中绝大多数为非小细胞肺癌(NSCLC)。NSCLC 的发生发展是一个复杂的过程，与细胞因子、癌基因等均关系密切。研究认为肝细胞生长因子(HGF)引导的信号通路(HGF/c-Met 信号通路)在NSCLC 的侵袭和转移中起重要作用［1］。c-Met 是原癌基因c-Met 编码的一种酪氨酸激酶受体，其配体是HGF。HGF/c-Met 信号通路的部分功能可能与黏附分子有关联。本研究探讨HGF 对人肺腺癌A549 细胞增殖、黏附、移动和侵袭能力的影响及其对c-Met 和E-cad 蛋白表达的影响，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 试剂

人肺癌细胞系A549，引自美国保藏中心(ATCC)。c-Met 多克隆抗体(浓缩型，工作浓度为1 ︰80)为Santa Cruz 公司产品;鼠抗人E-cad单克隆抗体(即用型)、免疫组化PV-9000 即用型试剂盒以及DAB 染色试剂购自福州迈新。采用日本Olympus BX53 显微镜系统进行成像和定量分析。人重组肝细胞生长因子(rhHGF)购自Neomark 公司;Transwell 小室购自Corning 公司;其它材料均购自Sigma 公司。

1.2 细胞培养和分组

人肺腺癌A549 细胞株用含10%小牛血清、100 U/mL 青霉素和链霉素的RPMI-1640 培养基，于37 ℃、5%CO2恒温培养箱内培养。细胞为贴壁生长，用0.25%的胰蛋白酶消化传代。按照给予rhHGF 的浓度分为4组(0、20、40、80 ng/mL)，不给予rhHGF 为对照组，其余为实验组。

1.3 MTT 法测定细胞增殖率

用100 μL 细胞悬液(8 ×104/mL)接种96 孔板，每组3 复孔，常规培养24 h 后，换无血清培养基培养(SFM)24 h;弃上清液，用rhHGF+SFM(分组同上)培养48 h;弃上清液，加入MTT 溶液，培养4 h;弃上清液，加入二甲基亚砜(DMSO)150 μL，振荡10 min，待结晶完全溶解。在酶联免疫仪570 nm 处测吸光值(A 值);实验结果判断:以A 值及细胞增殖率表示。细胞增殖率=(A实－A对)/A对×100%

1.4 黏附试验

在超净台中用Matrigel 胶包被96 孔板并风干过夜;2% BSA 50 μL/孔封闭，37 ℃孵育2 h，PBS 冲洗并弃去;将150 μL 细胞悬 液(2 ×105/mL 细胞+SFM)接种96 孔板，设3 复孔，常规培养2 h;弃去培养基，加入200 μL PBS/孔，轻轻抽吸吹打，去除未黏附细胞;弃去PBS，加入MTT 溶液，MTT 检测与增殖率检测方法相同。结果的计算:以A 值和黏附增加率来表示。黏附增加率=(A实－A对)/A对×100%。

1.5 移动、侵袭试验

根据Transwell 侵袭小室模型来完成。移动试验:24 孔板(下室)中按500 μL/孔加入SFM +10 ng/mL rhHGF 并设3 复孔;在每孔中放细胞培养小室(上室)，小室底部附有多聚碳酸酯膜(8 μm 孔)，将100 μL 细胞悬液(1 ×105/mL 细胞+SFM+不同浓度rhHGF)加入上室;常规培养10 h;用棉签轻轻拭去未穿膜细胞。纯甲醇固定，常规HE 染色。计数:显微镜下随机取5 个视野，计数穿膜细胞数，取平均值表示移动力数值。侵袭试验:上室底部的膜上均匀包被50 μL Matrigel，超净台中风干过夜;下室同移动试验，将2 ×105/mL 细胞+SFM+不同浓度rhHGF，按100 μL/孔加入;常规培养48 h;用棉签轻轻拭去Matrigel 及未穿膜的细胞;固定、染色、计数过程与移动试验一致。移动/侵袭增加率=(A实－ A对)/A对×100%。

1.6 免疫细胞化学检测蛋白

制备好细胞爬片，细胞达亚汇合状态。按实验设计分2组(0，80 ng/mL);弃去完全培养基，换SFM 继续培养24 h;弃去上清液，换SFM(含/不含HGF)继续培养24 h;弃去上清液，PBS 充分洗涤后，4%多聚甲醛固定。阴性对照由PBS 替代一抗;用图像分析软件分析各种蛋白的表达。

1.7 统计学分析

采用SPSS 17.0 统计软件分析数据，实验数据以均数±标准差来表示，不同实验组与对照组间的结果差异采用配对t 检验。

2 结果

2.1 HGF 对A549 细胞增殖和黏附性的影响

由表1 可见，实验组不同浓度的HGF 显著刺激A549 细胞的增殖，与对照组相比差异有统计学意义(P＜0.05)，其中40 ng/mL 可达到最大增殖效应。并且实验组与对照组相比，HGF 也明显增加A549 细胞的黏附能力(P＜0.05)，其中40 ng/mL HGF 黏附增加率最高。

表1 HGF 对A549 细胞生长和黏附性的影响

2.2 HGF 对A549 细胞体外移动力和侵袭力的影响

由表2 可见，实验组和对照组相比，HGF 增强了A 549 细胞的移动力和侵袭力(P 均＜0.05)，并且随着HGF 浓度加大，移动力和侵袭力也逐渐增强。

表2 HGF 对A549 细胞体外移动力和侵袭力的影响

2.3 HGF 对A549 细胞c-Met 和E-cad 蛋白表达的影响

HGF 在A549 细胞无着色，c-Met 蛋白表达位于胞浆。未加rhHGF 处理组，E-cad 蛋白阳性部位位于A549 细胞的胞膜，相邻细胞连接处明显。经HPIAS-2000 型图像分析软件分析，在rhHGF刺激下，c-Met 蛋白表达的灰度值为(202±30)，与未处理组(210±36)相比，差异无统计学意义;而E-cad 蛋白在细胞膜表达的灰度值，由未处理时的(180±15)显著下调为(140±13)(P＜0.05)。

3 讨论

HGF 是多效应的生长因子，能够刺激多种上皮、内皮和间质细胞的生长和血管生成，调节免疫活性，促进细胞增殖、移动和侵袭［1］。HGF 与跨膜蛋白c-Met 结合，c-Met 自体磷酸化，激活下游信号通路调节蛋白，引起酶促反应，发挥生物学效能，故又称为HGF/c-Met 系统或信号通路。HGF/c-Met 系统除了参与生理性过程，还通过配体依赖和独立机制参与肿瘤的发生发展如肺癌［2］。如HGF 可促进细胞集落分散，加强细胞的移动和侵袭能力。有学者认为细胞之间黏附力下降，相邻细胞连接松散促使细胞移动力增强。而以E-cad 为代表的细胞黏附分子是介导细胞与细胞、细胞与基质之间相互黏附的糖蛋白，在高侵袭力的肿瘤细胞经常可观察到E-cad 表达降低、缺失。

3.1 HGF 对A549 细胞的体外生物学效应

HGF/c-Met 信号系统在胚胎发育中扮演重要角色，具有强烈的促有丝分裂的作用［3］。HGF 能够显著促进人类肝细胞DNA 的合成，降低FasL介导的凋亡［4］。本研究证实rhHGF 可促进A549细胞的增殖，在40 ng/mL 可达到最大的增殖，提示抑制HGF 的活性可能成为NSCLC 治疗的新靶点［3］。Kasahara 等［4］报道NSCLC 患者血清HGF水平与EGFR-TKI 的治疗效果显著相关，可指导个体化治疗。

肿瘤细胞与基底膜黏附性的改变是有利于侵袭、转移的重要因素。HGF 能够增强肿瘤细胞与基底膜的黏附力，促进恶性肿瘤侵袭、转移。Elliott 等［5］在结直肠癌肝转移模型中，通过体内和体外实验发现HGF 激活c-Met 后，上调CD44 的表达，增强肿瘤细胞与上皮细胞、肿瘤细胞与细胞外基质的黏附性。本研究显示HGF 增加了A549细胞与Matrigel 胶(与基底膜主要成分相同)的黏附力，表明HGF 促使肿瘤细胞紧密黏附于基底膜上，便于瘤细胞侵袭基底膜。

细胞运动能力的大小反映了细胞侵袭、转移的潜能。Ross 等［6］研究证实HGF 可促进A549等多个NSCLC 细胞及Hela 细胞的移动，发现HGF 能够激活黏着斑蛋白—桩蛋白(paxillin)，致其丝氨酸126 位点和130 位点磷酸化，导致细胞的运动能力增加，在此过程中，ERK2 起着至关重要的作用。Puri 等用100 ng/mL EGF 和HGF 处理NSCLC 细胞(H1993)2 h，在诱导H1993 细胞的运动性特别是膜边缘波动中可导致累积效应［7］。本研究中移动、侵袭实验显示随着HGF 浓度提高，穿膜细胞数逐渐增加，说明HGF 明显提高了A549 细胞的运动能力及侵袭基底膜能力。一系列研究表明HGF/c-Met 信号通路激活后，细胞运动能力显著提高，并且与基底膜黏附性增强，更易于穿过基底膜，利于肿瘤细胞向远处转移。

3.2 HGF 对A549 细胞c-Met、E-cad 的作用

HGF 与c-Met 两者相互协调，激活多个信号通路，共同调控非小细胞肺癌的进展［2，6，8］。本实验发现A549 细胞c-Met 蛋白表达与HGF 无关，说明外源性HGF 通过旁分泌途径对c-Met 蛋白表达影响极小，可能只是使c-Met 胞内区磷酸化并激活c-Met，从而发挥生物学效能。

有研究发现HGF/c-Met 系统还可影响E-cad的表达。转染c-Met 的前列腺癌细胞株出现Ecad 表达下降，vimentin 表达升高，细胞显示上皮-间质转化［9］。Shimabukuro 等［10］发现加入HGF后，宫颈鳞状细胞癌SKG?Ⅲ细胞株E-cad 和actin表达下调，免疫荧光发现E-cad 膜荧光受到HGF干扰，转为核周荧光，并且肿瘤细胞的移动与侵袭能力加强，认为HGF 促使E-cad 表达降低，其介导的细胞与细胞之间黏附力缺失，导致侵袭性行为的产生。本研究发现HGF 可促使A549 细胞E-cad 蛋白表达下调，表明HGF 可下调E-cad 的表达，破坏E-cad/β?cat 复合物的形成，降低细胞间黏附力，增强细胞迁移能力，从而促进非小细胞肺癌的进展。在鼻咽癌的研究中也有类似报道，HGF 可通过调节E-cad 介导的细胞—细胞之间的黏附，主要是E-cad 的下调和细胞内摄作用，从而促进鼻咽癌的侵袭［11］。

综上所述，体外研究证实HGF 可刺激NSCLC的增殖，增加了肿瘤细胞与细胞基质黏附性。外源性加入HGF，肺癌细胞E-cad 蛋白表达下调，促进细胞的移动和侵袭，有利于肿瘤的扩散。对于HGF 信号通路的研究有望成为抗肿瘤转移治疗的新靶点。

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