FTY720对卵巢癌细胞增殖的影响及其机制研究

谭文华　刘　巍　李委佳　麻世红　王瑞雪



FTY720对卵巢癌细胞增殖的影响及其机制研究

谭文华刘巍李委佳麻世红王瑞雪

【摘要】目的探讨FTY720对卵巢癌细胞系OVCAR-3增殖的影响及其诱导凋亡的作用机制。方法应用不同浓度的FTY720作用于卵巢癌细胞系OVCAR-3，MTT法检测细胞生长抑制率，应用Annexin V-FITC/PI细胞凋亡双染试剂盒检测细胞凋亡率及分析细胞周期的变化，Western-blot法分析凋亡相关蛋白的变化。结果FTY720对OVCAR-3卵巢癌细胞系增殖的抑制作用具有时间、剂量依赖性。随着FTY720作用时间的延长，OVCAR-3细胞凋亡数量增多，且G1期细胞比例逐渐上升。Western-blot结果显示Caspase3和Caspase9都受到了激活。结论FTY720可以诱导人卵巢癌细胞系OVCAR-3发生凋亡，并且激活内源性Caspase途径和诱导细胞发生G1期阻滞，这可能是FTY720抑制卵巢癌细胞生长的作用机制之一。

【关键词】FTY720；OVCAR-3；细胞周期；作用机制

(ThePracticalJournalofCancer,2015,30:0013～0016)

卵巢癌是妇科常见的恶性肿瘤之一，其发病率占妇科肿瘤的第三位，病死率占妇科恶性肿瘤之首，目前其确切的发病机制尚不完全清楚。卵巢癌的早期诊断很困难，约70%的患者就诊时已是晚期，约75%在Ⅰ期治疗后就会复发、预后差[1]。手术辅以化疗是卵巢癌的主要治疗原则，然而目前针对卵巢癌的化疗药物的疗效不甚理想，这促使我们要不断的寻求抗卵巢癌新的治疗靶点以及方法来提高患者的治疗效果[2-4]。FTY720(2-amino-(2-[4-octylphenyl]ethy)-1，3-propanedial hydrochloride)是1种新合成的免疫抑制剂。目前其临床试验主要用于预防肾移植术后的免疫排斥反应[5]及治疗复发的多发性硬化症[6]。FTY720除了具有免疫抑制作用外，最近对于其治疗恶性肿瘤的研究已经成为国际上的热点[7]。多项研究表明，FTY720可以促进人类肿瘤细胞的凋亡，从而起到抗肿瘤的作用，包括多发性骨髓瘤[8]、肝癌[9]、前列腺癌[10]、乳腺癌[11]、肾肿瘤[12]和膀胱癌[13]。然而，关于FTY720对卵巢癌细胞的影响的研究还很少，因此，本课题旨在观察FTY720在细胞水平对卵巢癌细胞增殖及凋亡的影响，并检测凋亡相关蛋白的表达变化，最终确定FTY720对卵巢癌的治疗效果及其机制，为FTY720应用于卵巢癌的临床治疗提供坚实的理论和实践基础。

1材料与方法

1.1人卵巢癌细胞系

人卵巢癌细胞系OVCAR-3购于ATCC(American Type Culture Collection)公司。细胞培养于含HEPS 25 mmol/L、谷氨酰胺2.0 mmol/L、青霉素100 IU/mL、链霉素100 IU/mL和10%灭活小牛血清的RPMI 1640完全培养基(GIBCO BRL公司)中。

1.2主要试剂及仪器

FTY720购于圣克鲁斯生物技术公司，MTT试剂购于美国Sigma公司，Annexin V-FITC/PI细胞凋亡双染试剂盒购于北京嘉美纽诺生物技术公司，Caspase-3、Caspase-9多克隆抗体、流式细胞仪(FAC Scan，Becton Dickinson，美国)，蛋白质印记(Western blotting)检测试剂盒(SA2022)。蛋白质检测试剂盒购于南京建成生物工程研究所。

1.3主要方法

1.3.1MTT法检测卵巢癌细胞生存率FTY720终浓度分别为0 μM、5 μM、10 μM、15 μM、20 μM，培养48 h后检测FTY720不同浓度下对卵巢癌细胞生存率的影响；再将不同浓度的FTY720分别培养0、12、24、48、72 h，观察随着作用时间的延长FTY720对卵巢癌细胞生存率的影响。

1.3.2Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒检测卵巢癌细胞凋亡率选取不同浓度的FTY720(选用特定浓度的FTY720)加入试剂盒作用24～48 h，悬浮上述细胞离心、收集，贴壁细胞用不含EDTA的胰酶消化收集，用PBS洗涤细胞2次，收集细胞，加入Annexin V-FITC混匀后反应5～15 min，应用流式细胞仪检测两株卵巢癌细胞的凋亡率。检测数据输入Macintosh650计算机应用Cell Quest软件进行数据分析。每次计算10 000个细胞。

1.3.3FTY720作用于卵巢癌细胞后凋亡相关蛋白表达检测应用Real-time PCR、Western blotting方法检测Caspase-3、Caspase-9蛋白的表达。提取卵巢癌细胞的蛋白质；测定蛋白质的浓度；蛋白质SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳；将蛋白样本转膜；按照试剂盒所示采用蛋白质印记法检测。其中，一抗效价是1∶500～1∶1 000，选择对照为actin(50 μg)。

1.4统计学方法

应用SPSS13.0统计学软件进行分析，对计量资料采用方差齐性检验，如果方差齐性，则应用单因素方差分析法检验总体均数差异性，有显著差异的再进行两两比较，P<0.05为差异有显著性。

2结果

2.1FTY720对卵巢癌细胞OVCAR-3的生长抑制作用(图1)

FTY720对OVCAR-3卵巢癌细胞系的生长抑制作用具有明显时间和计量依赖性。选定5个不同浓度(0 μM、5 μM、10 μM、15 μM、20 μM)FTY720作用于OVCAR-3卵巢癌细胞系，作用24 h时，FTY720对卵巢癌细胞具有明显的增殖抑制作用，IC50(被抑制一半时抑制剂的浓度)值约为10 μM；作用48 h时抑制效果变得更加明显。因此，选用10 μM、15 μM这两个浓度进行以下实验。

2.2FTY720诱导人卵巢癌细胞OVCAR-3的凋亡

10 μM、15 μM的FTY720作用于OVCAR-3卵巢癌细胞系48 h后，应用Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒检测凋亡情况。发现10 μM FTY720可以明显诱导细胞凋亡，15 μM FTY720的效果则更加明显，早期和晚期的凋亡均能观察到，见图2。

2.3FTY720体外诱导人卵巢癌细胞OVCAR-3发生G1期阻滞

10 μM、15 μM的FTY720作用于OVCAR-3卵巢癌细胞系48 h后，应用流式细胞仪检测细胞周期的情况，发现FTY720可以有效使OVCAR-3细胞的生长阻滞在G1期，见图3。

2.4FTY720通过Caspase途径诱导卵巢癌细胞OVCAR-3发生凋亡

Western-blot方法检测发现，FTY720(10、15 μM)作用于OVCAR-3卵巢癌细胞系后，可以明显引起前体Caspase 3、Caspase 9的减少，表明caspase通路在FTY720作用后受到了激活，见图4。

图1　MTT法检测卵巢癌细胞生长抑制情况

图2　流式细胞仪检测OVCAR-3卵巢癌细胞系凋亡情况

图3　流式细胞仪检测OVCAR-3卵巢癌细胞系凋亡情况及G1期细胞百分率

图4　Western blotting法检测结果

3讨论

卵巢癌是妇科恶性肿瘤中死亡率极高的1种，因此对于卵巢癌的治疗已经成为了人们关注的热点，而化疗是治疗卵巢癌的一项重要手段，它可以有效地提高患者的生存期。然而，化疗药物的副作用及耐药性严重影响了化疗的效果，很多患者往往死于化疗药物的副作用而非卵巢癌本身，因此，寻找1种低毒性的化疗药物至关重要。FTY720是由中药冬虫夏草改造的1种新型免疫抑制剂，近期对于FTY720在治疗恶性肿瘤的研究已经成为国际上研究的热点。本实验通过体外实验，在细胞水平来探讨FTY720对卵巢癌细胞OVCAR-3增殖的影响及其作用机制。

实验结果表明，FTY720在体外作用24 h后可以有效抑制卵巢癌细胞OVCAR-3的生长，并且它的IC50值约为10 μM，并且与传统的化疗药物顺铂相比有着更小的毒副作用。同时，流式细胞仪的结显示，FTY720的浓度为10 μM时，可以明显诱导卵巢癌细胞OVCAR-3发生早期和晚期的凋亡，不仅如此，还可以使肿瘤细胞的生长停滞在G1期。这些结果证明了FTY720能够明显抑制卵巢癌细胞OVCAR-3的增殖，因此它对于卵巢癌细胞有着明显的治疗效果，因此可以进一步研究并应用到卵巢癌的临床治疗中。此外，我们还进一步研究了FTY720引起卵巢癌细胞凋亡的机制，结果显示FTY720作用于卵巢癌细胞株OVCAR-3后Caspase3、9被激活。众所周知，Caspase的活化是细胞凋亡的关键步骤，而死亡受体的结合相应配体(典型代表为Fas2FasL)以及应激条件下线粒体释放细胞色素C和Smac/DIABLO等内容物是Caspase激活的两条重要途径，其中，Smac/DIABLO是1种新近发现的线粒体膜间蛋白，与细胞色素C一样是Caspase的线粒体激活因子。该结果提示内源性凋亡系统在FTY720作用后被活化，线粒体跨膜电势降低，释放细胞色素C，最终启动Caspase酶系，导致了凋亡的发生。综上所述，药物FTY720在人卵巢癌OVCAR-3中具有诱导细胞凋亡的作用，并且可能是通过激活内源性Caspase途径和诱导细胞发生G1期阻滞来实现。本研究结果为今后将FTY720应用于临床治疗提供了一定的实验依据。

综上所述，FTY720可以明显抑制卵巢癌细胞的增殖，并且使细胞生长阻滞于G1期，并且通过激活内源性Caspase途径来诱导卵巢癌细胞系OVCAR-3发生凋亡。因此我们推断FTY720可能是通过激活内源性Caspase途径和诱导细胞发生G1期阻滞来实现对卵巢癌细胞OVCAR-3的凋亡作用。这个实验结果为我们以后对于FTY720应用于临床的研究提供了一定的实验依据和理论数据。为今后研究FTY720作用于卵巢癌的具体机制有着一定的提示作用。

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(编辑：吴小红)

Effect and Mechanism of FTY720 on the Proliferation of Ovarian Cancer Cells

TANWenhua，LIUWei，WANGRuixue.DepartmentofGynaecologyandObstetrics，theSecondHospitalAffiliatedtoHarbinMedicalUniversity，Harbin，150086

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of FTY720 on the proliferation of OVCAR-3 ovarian cancer cells and its mechanism of apoptosis-inducing in vitro.MethodsOVCAR-3 cells under different concentration of FTY720 were collected.The inhibition rates of cells were determined by MTT assay to evaluate the effect of FTY720.The percentage of apoptosis and cell cycle progression were detected by Annexin V-FITC/PI.Apoptosis related proteins were determined by western-blot.ResultsGrowth inhibition and apoptosis induction were evoked by different concentrations of FTY720 in OVCAR-3 cells in time and concentration dependent manner.FTY720 greatly inhibited human ovarian cancer cell OVCAR-3 proliferation.This effect was associated with G1phase cell cycle arrest and apoptosis.Wester-blot showed that caspase3 and caspase9 were activated.ConclusionFTY720 can inhibit the proliferation and induce OVCAR-3 cells apoptosis.Apoptosis induced by FTY720 may be regulated through G1phase cell cycle arrest and the activation of endogenous caspase pathway.

【Key words】FTY720；OVCAR-3 cells；Cell cycle；Mechanism

(收稿日期2014-04-29修回日期 2014-09-30)

中图分类号：R737.31

文献标识码：A

文章编号：1001-5930(2015)01-0013-04

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2015.01.004

通讯作者：王瑞雪

基金项目：黑龙江省教育厅课题(编号：12511196)
作者单位：150086 哈尔滨医科大学附属第二医院妇产科