磁性介孔二氧化硅用于药物传输和光动力治疗

汪文媚，吴伯岳，要 旸，高卫真,

(1.天津医科大学基础医学院药理学教研室，天津300070；2.天津医科大学医学检验学院，天津300203)

论著

磁性介孔二氧化硅用于药物传输和光动力治疗

汪文媚1，吴伯岳2，要 旸2，高卫真1,2

(1.天津医科大学基础医学院药理学教研室，天津300070；2.天津医科大学医学检验学院，天津300203)

目的：制备温度和pH双重响应的核壳结构磁性荧光介孔二氧化硅纳米粒子用于抗肿瘤药物传输以及协同光动力治疗。方法：采用溶剂热法、反相胶束法制备实心硅包覆的Fe3O4核，以改良的溶胶凝胶法制备介孔硅中间层，再以种子沉淀聚合法在介孔硅表面修饰温敏聚合物壳层，得到Fe3O4@SiO2(F)@mSiO2(P)@P(NIPAM-co-AA)纳米粒子。利用透射电子显微镜(TEM)对其形貌进行了表征。以盐酸阿霉素为模型药考察了该纳米粒子对药物的负载与释放行为，并采用MTT比色法对其进行了体外细胞活性评价。结果：TEM表征结果显示，该纳米粒子平均粒径约为300 nm。药物负载与释放结果表明，该纳米粒子不仅具有较高的载药量(206.75±17.59)μg/mg和包封率(68.91±5.86)wt%，药物释放也呈现明显的温度和pH依赖性。MTT结果表明，载药的纳米粒子在680 nm LED灯照射条件下与单用化学治疗和光动力治疗相比，对细胞的毒性明显增大 (P<0.01)。结论：Fe3O4@SiO2(F) @mSiO2(P)@P(NIPAM-co-AA)纳米粒子可作为一个抗肿瘤药物载体，实现肿瘤化疗和光动力治疗的协同研究。

介孔二氧化硅；磁靶向性；刺激响应；药物传输；光动力治疗

自1992年美国Mobil公司首次合成MCM-41型高度有序的介孔二氧化硅材料以来[1]，介孔二氧化硅纳米粒子(mesoporoussilica nanoparticles，MSNs)因其独特的孔道结构、有序可调的孔径大小、较高的比表面积和孔容、易于修饰的内外表面等特性[2],已广泛应用于生物成像[3]、生物传感[4]、药物传输[5]、光动力治疗[6]等生物医学领域。近年来，基于MSNs的多功能刺激响应型纳米载药系统更是成为该领域的研究热点[7]。光动力治疗(photodynamic therapy，PDT)是一种新兴的癌症治疗技术，是利用光敏剂在适当波长的光激发下将能量传递给周围的氧分子产生单线态氧(1O2)及其它活性氧自由基,造成肿瘤细胞或组织的氧化损伤，具有低毒、创伤性小等优点[8]，但其疗效却由于光敏剂的疏水性、易聚集、单线态氧(1O2)产率低、靶向性差等因素而大大受到限制[9]。然而MSNs因其良好的结构特性，不仅可以作为一个高效的载体装载疏水性光敏剂，同时其孔道结构也有利于增强氧分子与单线态氧的渗透性，因而受到广泛关注[10]。磁性四氧化三铁(Fe3O4)纳米粒子拥有优越的磁学性能、良好的生物相容性等，在磁共振成像（MRI）、磁热疗、靶向药物传输等方面应用前景广泛[11]。本文为了实现药物的靶向输送、可控释放以及化疗和光动力治疗的协同研究，并对药物传输过程进行荧光示踪，以掺杂异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）的实心硅包覆Fe3O4为核心，以掺杂光敏剂ZnPc的介孔硅为中间层，以交联的聚N-异丙基丙烯酰胺-co-丙烯酸为壳层，合成了温度和pH双重响应的核壳结构磁性荧光介孔二氧化硅纳米材料Fe3O4@SiO2（F）@mSiO2（P）@P（NIPAM－co－AA）（以下简称FSMP－NPs），并对其做了形貌表征，同时，以盐酸阿霉素（doxorubicin hydrochloride，DOX）为模型药物对其载药与可控释放能力、光动力学治疗效果、细胞毒性等进行了体外评价。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株 人宫颈癌Hela细胞株由天津市肿瘤医院提供，本实验室传代保种。

1.1.2 实验试剂 乙酰丙酮铁、苯甲醇、FITC、3-氨丙基三乙氧基硅烷 (APTES)、N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)、N,N’-亚甲基双丙烯酰胺(MBA)、过硫酸钾(KPS)、丙烯酸(AA，上海晶纯生化科技股份有限公司)；油胺(西格玛奥德里奇上海贸易有限公司)；聚氧乙烯醚(Brij58)、ZnPc、3-(异丁烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷(MPS)、1,3-二苯基异苯并呋喃(DPBF，北京百灵威科技有限公司)；油酸、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、二甲基亚砜(DMSO)、正硅酸乙酯(TEOS，天津市光复精细化工研究所)；浓氨水(25%，天津市福晨化学试剂厂)；3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT，碧云天生物技术研究所)；DOX (北京华奉联博科技有限公司)。

1.1.3 实验仪器 HT7700型透射电子显微镜（日本日立高新技术公司）；TU－1901双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；F－380荧光分光光度计（天津港东科技股份发展有限公司）；XL001WP01NRC 680 nm LED灯（深圳市希兰光电有限公司）；Universal320R高速冷冻离心机（德国Hettich公司）；IS－RDD3台式恒温振荡器（美国精骐有限公司）；Synergy 2化学发光检测仪（美国BioTek公司）。

1.2 方法

1.2.1 FSMP-NPs的合成

1.2.1.1 Fe3O4纳米粒子的合成：采用溶剂热法制备Fe3O4纳米粒子。将0.706 g乙酰丙酮铁、1.9mL油酸、1.9mL油胺分别加入20mL苯甲醇中，磁力搅拌得到橙黄色均一溶液，转入聚四氟高压反应釜中，密封加热至200℃反应10 h。将反应釜冷却至室温，得到黑色磁性纳米粒子，磁分离，沉淀用无水乙醇洗3次，每次20mL，最后分散于10mL环己烷中待用，产量约150mg。

1.2.1.2 实心硅包覆Fe3O4纳米粒子Fe3O4@SiO2(F)的合成：采用反相胶束法。首先10mg FITC和75 μLAPTES在5mL无水乙醇中避光反应24 h，反应产物于4℃保存。然后将2.8 g Brij58、0.15mL蒸馏水、1.5mLFe3O4环己烷溶液、0.56mL浓氨水分别加入11.25mL环己烷中，搅拌30min后，再分别加入1.0mLFITC-APTES溶液和1.5mLTEOS，50℃避光反应8 h。反应结束后，将合成产物磁分离，用无水乙醇洗3次，每次30mL。最后加至20mL无水乙醇中避光保存，产量约0.5 g。

1.2.1.3 介孔硅掺杂ZnPc包覆实心硅纳米粒子Fe3O4@SiO2(F)@SiO2(P)的合成：采用改良的溶胶凝胶法。反应前，先将10mg ZnPc溶于100mLDMSO和乙醇的混合溶液中(体积比1：1)，放置24 h后，轻轻倒出上清液得ZnPc饱和溶液。在250mL三颈瓶中，分别加入含0.4 g Fe3O4@SiO2(F)纳米粒子的乙醇溶液、0.34 g CTAB、1.0mL浓氨水和108mL蒸馏水，补加无水乙醇使反应体系为160mL；超声10 min后，再分别加入60mLZnPc饱和溶液和0.6mL TEOS，室温搅拌8 h。反应结束后，将合成产物磁分离，无水乙醇洗3次，每次30mL。最后加至20mL无水乙醇中保存，产量约0.4 g。

1.2.1.4 MPS修饰的Fe3O4@SiO2(F)@mSiO2(P)纳米粒子的合成：将含0.3 g Fe3O4@SiO2(F)@SiO2(P)纳米粒子的乙醇溶液(未除CTAB)、300μLMPS以及相应体积的无水乙醇分别加入250mL三颈瓶中，使反应总体系维持在150mL，80℃搅拌3 h。反应结束后，磁分离，沉淀用20mL无水乙醇洗2次，并将产物转入截留分子量为3 500的透析袋中，利用索氏提取原理，用乙醇洗涤CTAB 24 h。最后将洗涤后产物磁分离，用10mL无水乙醇洗1次、50mL蒸馏水洗5次，得到MPS修饰的Fe3O4@SiO2(F)@mSiO2(P)纳米粒子，并转移至8mL蒸馏水中保存，产量约120mg。

1.2.1.5 FSMP-NPs的合成：采用种子沉淀聚合法。将含0.1 gMPS修饰的Fe3O4@SiO2(F)@mSiO2(P)纳米粒子超声分散于20mL蒸馏水中后，转移至100mL三颈瓶中，再将0.45 g NIPAM、0.05 g AA和0.025 gMBA溶于30mL蒸馏水中后加入其中。机械搅拌下通氩气，待温度上升至75℃时，加入0.015 g KPS，继续反应5 h。反应结束后，磁分离，用100mL蒸馏水洗5次以除去未反应的单体和聚合物，得到多功能磁性介孔二氧化硅纳米粒子Fe3O4@SiO2(F) @mSiO2(P)@P(NIPAM-co-AA)，并将其分散于20mL蒸馏水中，保存待用，产量约60mg。

1.2.2 FSMP-NPs的表征 FSMP-NPs的形貌采用透射电子显微镜(TEM)进行观察。将FSMP-NPs分散于蒸馏水中，配成10μg/mL溶液，超声分散均匀。然后用滴管将溶液滴1滴在覆有碳膜的铜网上，室温干燥后，置于透射电子显微镜下观察。用荧光分光光度计测量FSMP-NPs的荧光强度。将FSMPNPs分散于水溶液中，并置于磁铁附近，观察其水分散性及磁响应性。

1.2.3 单线态氧(1O2)的检测 将750μLDPBF(300 μg/mLDMSO溶液)加到29.25mLFSMP-NPs溶液(300μg/mLDMSO溶液)中，DPBF终浓度为7.5μg/ mL。将混合液分成9管，每管3mL，分别使用680 nm LED灯照射0、0.5、1、2、4、6、8、10min以及避光保存10min。另以7.5μg/mLDPBF的DMSO溶液以同样方式处理作为对照。采用UV-vis光谱扫描,记录各组在417 nm处的吸光度值。

1.2.4 药物负载实验 将10mg FSMP-NPs加到10 mL含0.3mg/mLDOX的0.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中，超声混合均匀后，放于恒温振荡器中避光振荡24 h(25℃，200 r/min)。将载药后产品离心分离(5 000 r/min，5min)，收集上清液，沉淀用上述缓冲液洗2次，每次10mL以洗去表面吸附的DOX，最后将洗液与上清液混合，采用UV-vis光谱扫描，测定其在480 nm处的吸光度。利用事先绘制好的DOX标准曲线计算游离药物含量，再计算药物负载量和包封率。沉淀放于4℃冰箱保存，后续做释放实验。

1.2.5 药物释放实验 取4管载药后的DOXFSMP-NPs沉淀约12mg，分别加入5mL 0.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.4)和0.01mol/L乙酸盐缓冲液(pH 5.5)，放于37℃或25℃恒温振荡器中振荡(200 r/min)。每管分别振荡2、4、6、8、23、26、32和48 h后，将DOX-FSMP-NPs溶液离心分离(5 000 r/min，5min)，小心吸取上清液3mL(并补加等体积新的缓冲液继续振荡)。采用UV-vis光谱扫描，并记录各上清液在480 nm处的吸光度，利用事先绘制好的DOX标准曲线计算药物累积释放率。

1.2.6 细胞毒性实验 采用MTT比色法检测细胞活性。Hela细胞培养于含10%胎牛血清、1%双抗(100U/mL青霉素，100μg/mL链霉素)的RPMI1640培养基中，并放于37℃、含5%CO2的饱和湿度培养箱中培养，每隔2 d传代1次，取对数生长期细胞进行实验。

为了评价FSMP-NPs的细胞生物相容性，用0.25%胰蛋白酶消化细胞后制成单细胞悬液，按每孔约5×103个细胞密度接种于96孔板中，每孔终体积为200μL，并设置只含有培养基的孔作为调零孔。在培养箱中培养24 h后，细胞换液，向实验孔中分别加入不同浓度的FSMP-NPs溶液10μL，使其终浓度分别为40、50、60和75μg/mL，每个浓度设置3个平行孔，以只加入10μL 0.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.4)的孔作为对照孔。继续培养24 h后，每孔加入20μLMTT(5mg/mL)溶液，4 h后小心吸弃培养液，每孔加入150μLDMSO，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。用化学发光检测仪测定每孔在570 nm波长处的吸光度，按以下公式计算细胞存活率。

CV(%)=(A-A0)/(A1-A0)×100%

CV为细胞存活率，A为实验孔OD值，A0为调零孔OD值，A1为对照孔OD值。

对于化疗、光动力治疗以及化疗和光动力治疗的协同研究，分别向细胞中加入终浓度为10μg/mL的纯DOX，60μg/mL的DOX-FSMP-NPs(DOX浓度为10μg/mL)，50μg/mL的FSMP-NPs(以下简称FSMP-NPs+Light)以及60μg/mL的DOX-FSMPNPs(DOX浓度为10μg/mL)(以下简称DOX-FSMPNPs+Light)，并使用680 nm LED灯照射10min，随后采用上述MTT比色法进行细胞毒性测试。

2 结果

2.1 FSMP-NPs的表征

2.1.1 FSMP-NPs的微观形态 通过透射电子显微镜对FSMP-NPs的形貌进行观察。由图1A可看到FSMP-NPs呈现出良好的球形形状，具有优异的单分散性，平均粒径约为300 nm。由图1B可清晰地看到FSMP-NPs有着规则的孔道结构，并且可观察到其中包裹了黑色纳米粒子。

2.1.2 FSMP-NPs的磁性 由图2可知，FSMP-NPs在无磁场存在条件下在水中分散均匀，而在有磁场存在下，FSMP-NPs立即聚集到磁场附近，水溶液呈无色透明状态，并且无FSMP-NPs游离出来。

图1 FSMP-NPs的透射电镜表征图(A.×15 000,B.×120 000)Fig 1 TEM im agesof FSMP-NPs

图2 FSMP-NPs在无(A)和有(B)磁场存在条件下的水分散性Fig 2 Thewater dispersibility of FSMP-NPs in absence of(A)and in presenceof(B)magnetic field

2.1.3 FSMP-NPs的荧光光谱分析 由图3可知，当用470 nm激发时，FSMP-NPs仅在520 nm处出现了一条发射峰，与FITC的发射峰相对应；当改变激发波长到604 nm时，仅在675 nm处出现了一条发射峰，与ZnPc发射峰相对应。

图3 FITC(A),FSMP-NPs(B)(470 nm激发)和FSMP-NPs(C), ZnPc(D)(604 nm激发)的相对荧光强度Fig3 Norm alized fluorescence intensity of FITC(A),FSMP-NPs (B)excited at470 nm and FSMP-NPs(C),ZnPc(D)excited at 604nm

2.2 单线态氧 (1O2)的检测结果分析 DPBF可与1O2不可逆结合产生内过氧化物，使其在417 nm处的吸光度降低。图4是用680 nm LED灯在不同时间照射下FSMP-NPs+DPBF以及DPBF在417 nm处的吸光度变化。由图4A可知，在FSMP-NPs+ DPBF条件下，随着照射时间的延长，DPBF在417 nm处的吸光度持续下降；然而在只有DPBF的条件下，随着照射时间的延长，并没有看到明显的吸光度降低(图4B)。

2.3 药物负载结果分析 DOX在480 nm处有很强的紫外吸收峰，将DOX溶液稀释成特定浓度，测定其在480 nm处的吸光度，得到DOX的浓度-吸光度标准曲线y=0.016 0x+0.0034,R2=0.999。由标准曲线计算得FSMP-NPs的平均载药量和包封率分别为(206.75±17.59)μg/mg、(68.91±5.86)wt%。

2.4 药物释放结果分析 通过DOX释放曲线y= 0.024 1x+0.020 1，R2=0.999(pH 5.5)和y=0.014 8x+ 0.014 3，R2=0.996(pH 7.4)计算药物累积释放率。所得结果见图5，在温度为37℃时，pH 5.5条件下DOX在48 h的累积释放率高达40 wt%，而在pH 7.4条件下累积释放率却不足10wt%；在温度为25℃时，pH 5.5条件下DOX在48 h的累积释放率约为30wt%，而在pH 7.4条件下的累积释放率只有5 wt%。

2.5 细胞毒性实验结果分析 由图6A可知，当FSMP-NPs浓度为50μg/mL时，平均细胞存活率约为88%，对细胞基本没有毒性(P=0.144)；当浓度为60μg/mL时，平均细胞存活率约为77%，开始表现出细胞毒性(P=0.013)。由图6B可知，DOX-FSMPNPs组即化疗组和FSMP-NPs+Light组即光动力治疗组的细胞存活率分别为 (38.63±2.32)%、(60.87± 8.13)%，且两者协同治疗组DOX-FSMP-NPs+Light组的细胞存活率降低到了(20.63±2.55)%，差异具有统计学意义(P<0.01)。

图6 不同浓度FSMP-NPs对Hela细胞存活率的影响 (A)以及在含FSMP-NPs浓度为50μg/m L,DOX浓度为10μg/m L时不同条件下对Hela细胞存活率的影响(B)Fig 6 Viability of Hela cells(A)treated w ith FSMP-NPsatdifferent concentrationsand(B)treated w ith FSMP-NPs,FSMP-NPs+Light,free DOX,DOX-FSMP-NPsand DOX-FSMP-NPs+Light(theconcentration of FSMP-NPsis50μg/m L and DOX is10μg/m L)

3 讨论

基于介孔二氧化硅的有机无机核壳结构纳米粒子作为药物传输载体已经引起了极大的关注。2001年首次报道MSNs作为纳米载体用于输送药物分子[12]，但当时仍缺乏对药物分子实现控释的概念。近年来，研究者把目光主要集中在以MSNs为主材料的多功能刺激响应纳米载体系统。由于恶性肿瘤组织的温度比正常组织稍高，pH值比正常组织低[13]，因此可以利用此特点来实现抗肿瘤药物的控释。聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAM)是一种常用的温敏性聚合物，当加热到其最低临界相转变温度(LCST)32℃以上时，会发生从亲水的溶胀状态到疏水的蜷缩状态的转变，与亲水性单体共聚可以提高其LCST[14]。聚丙烯酸(PAA)是一种重要的对pH敏感的亲水性聚合物，因具有良好的生物相容性，已经广泛用于pH响应性药物载体的制备[15]。

本文为了实现药物的靶向输送和可控释放，合成了温度和pH双重响应的磁性荧光介孔二氧化硅纳米粒子，透射电镜结果表明，磁性纳米粒子Fe3O4被成功地包覆进二氧化硅壳层中，形成具有核壳结构的磁性介孔二氧化硅纳米粒子(图1)，且磁性实验表明该纳米粒子具有优异的磁响应性(图2)。图3所示荧光测定结果说明，在407 nm和604 nm波长激发下，FSMP-NPs显示了不同的荧光发射光谱，并与FITC和ZnPc发射谱相对应，说明FITC和ZnPc被成功地包覆在FSMP-NPs内。我们使用DPBF来考察所合成的药物载体的1O2产生情况。从图4A可以看出，随着680 nm LED灯光的照射，DPBF在417 nm处的特征吸收不断变小，而将DPBF与载体在非光照条件下共混10min其紫外吸收不会产生明显变化；另一方面，使用上述光源单独照射DPBF 10 min其紫外吸收也不会产生明显变化。以上结果说明，DPBF紫外吸收下降，是由于680 nm光源照射载体，激发其中所含ZnPc产生的1O2所致。图5给出的药物释放结果表明，我们所合成的药物载体，其药物释放过程具有明显的温度和pH依赖性，达到了刺激响应性可控释放的目的。MTT结果表明，当细胞培养环境中FSMP-NPs浓度为50μg/mL时并不表现出明显细胞毒性，可以此浓度进行后续实验(图6A)。为了更有效地杀伤肿瘤细胞，我们将化疗和光动力治疗结合，并通过MTT法对治疗效果进行体外评价。由图6B可知，实验采用60μg/mL DOX-FSMP-NPs+Light(DOX浓度为10μg/mL)为实验组，通过与DOX-FSMP-NPs组、FSMP-NPs+Light组以及纯DOX组的细胞存活率对比可以发现，采用化疗和光动力联合治疗，其肿瘤细胞生存率明显低于单独进行光动力治疗或化疗，具有更好的肿瘤治疗效果。

综上，本实验合成了一种基于磁性介孔二氧化硅的温度/pH双重响应性的药物载体，通过在其中掺杂光敏剂ZnPc，有望实现针对肿瘤靶向性药物和光动力的协同治疗。

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（2014-09-12收稿）

M agneticmesoporoussilica nanoparticles for drug delivery and photodynam ic therapy

WANGWen-mei1,WUBo-yue2,YAOYang2,GAOWei-zhen1,2
(1.Departmentof Pharmacology,Schoolof Basic Medical Sciences,Tianjin MedicalUniversity,Tianjin 300070,China;2.SchoolofMedical Laboratory,Tianjin MedicalUniversity,Tianjin 300203,China)

Objective：To prepare temperature-pH responsive and core-shell-structured magnetic fluorescentmesoporous silica nanoparticles for antitumor drug delivery and photodynamic therapy.Methods:First,the core of nonporous silica coated Fe3O4was prepared viasolvothermal reaction and reversemicellemethod,thenmesoporoussilicaas themiddle layerwas furthercoated on the coreby modified sol-gelprocess,and finally the Fe3O4@SiO2(F)@mSiO2(P)@P(NIPAM-co-AA)nanoparticleswere preparedwith the polymershell modified on themiddle layer through seed precipitation polymerization.Transmission electron microscopy (TEM)was carried out to characterize themorphologyof thenanoparticles.Doxorubicin hydrochloride(DOX)wasused asamodeldrug to investigate the drug loading and releasing behavior.And MTT assay was adopted to evaluate the biocompatibility and cytotoxicity of the nanoparticles.Results:The resultsof TEM showed that the average diameterof the nanoparticleswas300 nm.The drug loadingand releasing results indicated thatthe nanoparticlesexhibited an excellentdrug loading contentof(206.75±17.59)μg/mgand encapsulation efficiency of(68.91±5.86)wt%,and controlled drug releasing could beobtained by changing the temperatureorpH values.MTTassay showed thatthe cytotoxic effectofDOX-loaded nanoparticles irradiated with a 680 nm LED lamp was significantly higher than thatachieved by chemotherapy and photodynamic therapy alone.Conclusion:Fe3O4@SiO2(F)@mSiO2(P)@P(NIPAM-co-AA)nanoparticles could be used as an antitumor drug carrier to achievea synergistic effectby combining chemotherapyand photodynamic therapy.

mesoporous silicananoparticles;magnetic targeting;stimuliresponse;drug delivery;photodynamic therapy

R9

A

1006－8147（2015）01-0029-06

国家自然科学基金青年基金资助项目(21205087)

汪文媚(1989-)，女，硕士在读，研究方向：纳米材料在药物传输方面的应用；通信作者：高卫真，E-mail：weizhengao33@163. com。