FOXQ1稳定表达乳腺癌细胞系的建立及鉴定

蔡隽（天津医科大学肿瘤医院肿瘤研究所，国家肿瘤临床医学研究中心，天津市“肿瘤防治”重点实验室，乳腺癌防治教育部重点实验室，天津 300060）

论著

FOXQ1稳定表达乳腺癌细胞系的建立及鉴定

蔡隽
（天津医科大学肿瘤医院肿瘤研究所，国家肿瘤临床医学研究中心，天津市“肿瘤防治”重点实验室，乳腺癌防治教育部重点实验室，天津 300060）

目的：建立稳定过表达FOXQ1乳腺癌细胞系，为进一步研究FOXQ1在体内乳腺癌转移、血管生成、抗凋亡机制，以及以FOXQ1为靶点开发抗肿瘤药物提供细胞研究模型。方法：采用脂质体转染的方法将真核表达质粒FOXQ1转染至MDA-MB-231-luc细胞，经G418筛选及克隆化培养，获得稳定过表达FOXQ1蛋白的细胞系。通过RT-qPCR、Western blot对细胞系中FOXQ1的表达进行鉴定。通过Transwell迁移侵袭等实验，观察过表达FOXQ1后对231-luc细胞EMT相关蛋白表达、231-luc细胞迁移侵袭等生物学特性的影响。结果：获得过表达FOXQ1的稳定细胞系，迁移侵袭实验表明该细胞系恶性化程度明显高于野生型。结论：成功建立稳定过表达FOXQ1的乳腺癌细胞系，FOXQ1在细胞核中高表达，进而增加EMT间质标志物Fn1、Vim的表达，增强231-luc的迁移侵袭能力。

FOXQ1；过表达；乳腺癌；迁移；侵袭

乳腺癌是一种高度异质性的肿瘤，同一分期、同一病理类型并采用相同治疗方案的患者，预后疗效不尽相同。传统的诊断治疗方法虽然有一定效果，但不能快速准确地诊断乳腺癌分子亚型并进一步指导乳腺癌的个体治疗。与此同时，越来越多的研究证实乳腺癌预后与许多分子标志物密切相关，因此探索乳腺癌发病、转移的分子机制成为乳腺癌诊断治疗的热点。叉头框转录因子（forkhead box，FOXs）是一类进化保守的转录调控因子，由于其转录调控功能的多样性，可调控细胞的增殖、分化、凋亡和迁移等广谱生物学过程，而FOXs基因的突变和失调常常是肿瘤发展和疾病发生的关键因子[1]。其中，FOXQ1的表达与多种肿瘤的发生发展均存在密切关系[2-7]。为了更好地研究FOXQ1在乳腺癌发病、转移中的作用，本研究成功建立稳定过表达FOXQ1 的MDA-MB-231-luc细胞系。这为进一步开展体内、体外实验，研究其在乳腺癌发生发展中的功能奠定了坚实的实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系和试剂 乳腺癌细胞系MDA-MB-231-luc-D3H2LN（231-luc，MDA-MB-231表达荧光素酶的亚克隆）来自美国Caliper Life Sciences公司。RPMI-1640培养基及胎牛血清购自美国Gibco公司，G418购自美国Sigma公司，RNA抽提试液Trizol、反转录试剂、实时定量 PCR试剂、LipofectamineTM 2000均购自美国Invitrogen公司，Transwell小室购自美国BD公司。

1.1.2 抗体 FOXQ1抗体购自美国Abcam公司，Fn1和Vim抗体购自美国BD公司，Flag和β-actin抗体购自美国Sigma公司，辣根过氧化物酶标记（HRP）的羊抗鼠抗体和HRP标记的羊抗兔抗体购自Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 231-luc细胞采用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液，5%CO2、37℃条件下培养。将对数生长期细胞用0.25%胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液，用于体外实验。

1.2.2 FOXQ1质粒鉴定 FOXQ1（myc-ddktagged）质粒购自美国OriGene公司，载体为pCMV6 Entry，采用Sgf I和Mlu I限制性内切酶插入FOXQ1完整的ORF序列，C末端带有myc和ddk（即Flag）标签蛋白。转化DH5α感受态细胞，用含卡那霉素的LB琼脂糖平板培养，扩增后送北京六合华大基因公司测序验证，确认表达框无误。

1.2.3 建立稳定过表达FOXQ1细胞系 将FOXQ1质粒按照LipofectamineTM 2000使用说明书转染231-luc细胞，24 h后重悬细胞，细胞密度为5 000个细胞每10 cm的培养皿，48 h后用含有G418的培养液筛选稳定转染的细胞克隆。待组成克隆的细胞数约为60个时，胰酶消化细胞并培养、提取细胞mRNA和蛋白，分别进行RT-qPCR和Western blot验证。

1.2.4 RT-qPCR检测FOXQ1的表达 收集转染24 h的细胞，用PBS冲洗2遍，加500 μL Trizol裂解液到6孔板，室温放置20 min，提取总RNA并反转录。RT-qPCR反应为20 μL体系，包括由40 ng 总RNA反转录所得的cDNA。PCR反应条件为50℃2 min，95℃2 min，95℃30 s，62℃1 min，40个循环。CT值为荧光信号达到设定阈值时所经过的循环数。计算各样本待测基因的CT值与GAPDH的CT值的差即△CT，2-△CT则为该样本中待测基因相对于GAPDH mRNA的表达量。

1.2.5 Western blot 收集转染48 h细胞，PBS重洗2遍，加入100 μL细胞裂解液到6孔板中收集细胞，冰浴30 min，4℃，12 000 r/min离心10 min，收集上清定量。加热变性后，每组取40 μg总蛋白经SDS-PAGE变性电泳并转至PVDF膜上。5%脱脂奶粉（pH 8.3的TBS-T配制）室温封闭1 h后，加入一抗，4℃孵育过夜。TBS-T洗膜3次后加入HRP标记的二抗，室温孵育1 h，TBS-T洗膜5次后与ECL化学发光试剂显色1～2 min，曝光X胶片。

1.2.6 Transwell迁移实验检测细胞的迁移能力取对数生长期的细胞，胰酶消化后，细胞计数。上室加入500 μL含2.5×104个细胞的无血清RPMI-1640重悬的细胞悬液，下室加入750 μL含20%FBS培养液。置于孵箱培养12 h后，用棉签擦去基质胶和小室内的细胞，4%多聚甲醛固定20 min，Gimesa染色20 min后去离子水洗3遍，封片，镜下观察计数并采集图像。

1.2.7 Transwell侵袭实验检测细胞的侵袭能力

首先将-20℃保存的Matrigel Invasion Chamber（包被有Matrigel胶以模拟体内基底膜）室温放置30 min，在上室、下室中各加入500 μL无血清RPMI-1640，37℃孵箱水化2 h后，弃去无血清RPMI-1640。其余操作同迁移实验。

2 结果

2.1 稳定过表达FOXQ1的231-luc乳腺癌细胞系的建立 见图1。人乳腺癌细胞系231-luc转染FOXQ1质粒后，经G418筛选获得稳定细胞系231-luc-Clone1、231-luc-Clone2和 231-luc-Clone3。RT-qPCR和Western blot结果显示，与野生型细胞相比，Clone1/2/3细胞中FOXQ1 mRNA和蛋白表达量均增加，其中Clone1和Clone3细胞中的FOXQ1表达量较Clone2更为明显。由于FOXQ1的C末端带有Flag标签，所以用Flag的抗体也可以反映出FOXQ1在231-luc各个稳定克隆中的表达情况，Western blot检测Flag结果与FOXQ1结果相一致。结果表明筛选得到的231-luc克隆细胞中FOXQ1稳定过表达。

图1 RT-qPCR和Westernblot证实稳定过表达FOXQ1的231-luc细胞系构建成功Fig 1 RT-qPCR and Western blot confirmed that stable cell lines 231-luc with over-expression of FOXQ1were successfully established

2.2 稳定过表达FOXQ1的231-luc细胞的形态变化 观察平板中生长的稳定过表达FOXQ1的231-luc细胞发现，Clone1细胞明显变得细长，伪足增多，间质化特征更加明显（图2）。

图2 细胞形态观察（×200）Fig 2 The cell morphology of 231-luc,231-luc-Clone1（×200）

2.3 稳定过表达FOXQ1的231-luc细胞的上皮间质转化增强 采用Western blot方法检测231-luc稳定过表达 FOXQ1克隆中上皮间质转化（epithelial-mesnchymal transition，EMT）间质标志物Fn1和Vim蛋白的表达，由图3可知，与野生型细胞相比，3个克隆中Fn1和Vim蛋白表达量均明显增多，其中Clone1和Clone3的Fn1和Vim蛋白表达变化水平较Clone2的表达更明显，这与图1中各个克隆中FOXQ1稳定过表达水平相一致。

图3 Western blot分析231-luc、231-luc-Clone1、231-luc-Clone2 和231-luc-Clone3中Fn1和Vim蛋白表达量Fig 3 Fn1 and Vim expression in 231-luc cell lines by Western blot analysis

2.4 过表达FOXQ1增强231-luc的迁移能力 对231-luc、231-luc-Clone1、231-luc-Clone2和231-luc-Clone3 4组细胞进行Transwell迁移实验，图4结果显示，稳定过表达FOXQ1的231-luc克隆穿过的细胞数明显多于野生型的231-luc。

2.5 过表达 FOXQ1增强 231-luc的侵袭能力Transwell侵袭实验结果显示，稳定过表达FOXQ1 的231-luc克隆细胞穿过铺有Matrigel胶基底膜的的细胞数明显多于野生型。说明过表达FOXQ1可增强231-luc的侵袭能力（图5）。

图4 过表达FOXQ1增强231-luc的迁移能力（×200）Fig 4 Over-expressing of FOXQ1 promoted the migration ability of 231-luc（×200）

图5 过表达FOXQ1增强231-luc的侵袭能力（×200）Fig 5 Over-expressing of FOXQ1 promoted the invasion ability of 231-luc（×200）

3 讨论

人FOXQ1基因属于FOXQ基因亚家族,位于人染色体6p25.3,编码403个氨基酸，能够识别和结合特异性的DNA序列为[A(A/T)TGTTTA(G/T)(A/T) T]。FOXQ1是上皮细胞极性的重要调节物，参与调节体内许多器官发育中的上皮分化和细胞增殖[8]。近些年来发现FOXQ1转录因子在肝癌[2]、非小细胞肺癌[3]、胃癌[4]、结肠癌[5]、膀胱癌[6]、乳腺癌[7]等许多肿瘤中高表达，并与肝癌、肺癌、结肠癌、乳腺癌等肿瘤的预后差有密切关系。FOXQ1在癌症发生中起到的作用也受到越来越多的关注。

Kaneda等[5]发现FOXQ1在结肠癌中过表达，导致VEGFA、WNT3A、RSPO2和BCL11A等促肿瘤生长的因子表达上调，从而促进结肠癌的发生发展、血管生成以及抗凋亡。这提示FOXQ1可能在乳腺癌中也存在介导血管生成和抗凋亡作用。有文献报道，MCF7、BT20等多种上皮细胞系过表达FOXQ1会造成细胞大量死亡[7]。为了研究FOXQ1在体内乳腺癌转移中是否也存在调控血管生成、抗凋亡机制，我们选择表达荧光素酶的231-luc细胞构建过表达FOXQ1的稳定克隆。

本研究将表达FOXQ1-myc-ddk的真核表达质粒转染231-luc细胞，通过G418筛选，利用RT-qPCR和 Western blot方法检测发现，FOXQ1在231-luc-clone1/2/3中的表达量均较野生型231-luc中的表达量明显增加。

EMT是细胞迁移运动能力改变的重要机制。此过程中，粘连的上皮细胞失去细胞间连接和细胞极性并获得间质特性，包括间质基因表达、纤维状表型、细胞骨架发生的重大改变等，使得其表现出运动性和浸润性增加[9-11]。大量证据表明，EMT在肿瘤的进展和转移中发挥重要作用[12-13]。实验发现稳定过表达FOXQ1的3个231-luc克隆中，Clone1和Clone3的FOXQ1表达量明显比Clone2多，在形态学上也较231-luc野生型更为细长，伪足数量显著增加，间质标志物Fn1、Vim的蛋白表达明显增多，并且迁移侵袭能力更强，这表明过表达FOXQ1能够促进EMT的发生。这与文献报道FOXQ1可通过直接抑制E-cadherin[7]，诱发乳腺上皮细胞发生EMT，进而发生转移的结论相一致。上述实验结果表明稳定过表达FOXQ1的231-luc细胞系构建成功。

有文章报道称FOXQ1抑制阿霉素或喜树碱所诱导的细胞凋亡[5]，细胞凋亡功能的异常不仅在肿瘤的发生和发展过程中发挥了重要作用，还参与介导肿瘤细胞的多药耐药，使肿瘤细胞对多种化疗药物的凋亡耐受产生耐药性[14-17]。这提示FOXQ1可作为乳腺癌治疗上的一个突破点，对基底样乳腺癌的治疗具有重大指导意义。此外，本研究中，笔者成功筛选得到多个FOXQ1过表达且FOXQ1表达程度不同的231-luc稳定克隆细胞系，这就为进一步研究FOXQ1在体内乳腺癌转移、血管生成、抗凋亡机制以及以FOXQ1为靶点开发抗肿瘤药物提供了有用的细胞研究模型。

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Establishment and identification of cell lines with stable expression of FOXQ1 in MDA-MB-231-luc

CAI Jun
（Cancer Institute and Hospital,Tianjina Medical University,National Clinical Research Center of Cancer,Tianjin Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy,Key Laboratory of Breast Cancer Prevention and Therany,Tianjin Medical Uniersity,Ministry of Education,Tianjin 300060,China）

Objective：To establish stable breast cancer cell line expressing FOXQ1 protein and to identify its biological characteristics.Methods：The plasmid FOXQ1 was stably transfected into MDA-MB-231-luc cells by Lipo-2000.After screening the culture by G418,the expression of FOXQ1 was detected by RT-qPCR and Western blot,and then series of experiments such as cell migration and invasion assay were performed to check the change of MDA-MB-231-luc cells in its aggressive behavior.Results：It was proved that MDA-MB-231-luc cells over-expressing FOXQ1 become more malignant than the control.Conclusion：The stable breast cancer cell sublines over-expressing FOXQ1 can be successfully established.Over-expression of FOXQ1 could promote cell migration and invasion of 231-luc.

FOXQ1;over-expression;breast cancer;migration;invasion

R737.9

A

1006－8147（2015）04-0292-04

蔡隽（1989-），女，硕士在读，研究方向：生物化学与分子生物学；E-mail:caijun9865@126.com。