GSNO对鸡球虫LDH和G-6-PD活性的影响

徐 凯王建玉刘幸昌杨君照姚顶林

（1.盐城市农产品质量监督检验测试中心，江苏盐城 224400；2.阜宁县动物卫生监督所，江苏阜宁 224400；3.阜宁县陈良镇人民政府，江苏阜宁 224400；4.泰州市高港区畜牧兽医站，江苏泰州 225300）

GSNO对鸡球虫LDH和G-6-PD活性的影响

徐 凯1王建玉2刘幸昌2杨君照3姚顶林4

（1.盐城市农产品质量监督检验测试中心，江苏盐城 224400；2.阜宁县动物卫生监督所，江苏阜宁 224400；3.阜宁县陈良镇人民政府，江苏阜宁 224400；4.泰州市高港区畜牧兽医站，江苏泰州 225300）

资料显示，GSNO对鸡球虫卵囊有较强的抑制作用，可以完全阻止E.tenella的孢子生殖，球虫卵囊的孢子生殖是一有氧呼吸过程，为了探索GSNO对球虫卵囊呼吸有关酶活性的影响，本实验利用PAGE法分析了与呼吸关系密切的乳酸脱氢酶（LDH）和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G-6-PD）。电泳后活性染色结果表明，GSNO处理的未孢子化和孢子化卵囊的LDH和G-6-PD条带与对照组的没有明显区别，这提示LDH和G-6-PD的活性没有受到GSNO的影响。

柔嫩艾美耳球虫 亚硝基谷胱甘肽 乳酸脱氢酶 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶

鸡球虫病是集约化鸡场常见病之一，其发病率为50%～70%，死亡率为20%～30%，严重时可达80%[1～2]。在鸡的各种禽病中，球虫病发病率最高[3]，1/6～1/5。估计每年全球因3病的损失为8亿元，在我国仅抗球虫药的年消费额就达2.4～4.8亿人民币[5]。鸡球虫病的病原体属艾美耳属，世界上公认有7种，分别是柔嫩艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫、布氏艾美耳球虫、和缓艾美耳球虫、早熟艾美耳球虫，另有哈氏艾美耳球虫和变位艾美耳球虫两个可疑种。鸡球虫没有交叉免疫原性[6]，鸡可以同时感染几种球虫，而且不同的地理区域球虫种类的分布和优势种有所不同[7，8]。不同种类的球虫其致病性有着很大的差异[9]，而且对同一种药物的敏感性也不一致，因而了解不同地理区域球虫种类的分布对于鸡球虫病的防治具有指导意义。鸡球虫病对雏鸡和育成鸡的危害十分严重，15～50日龄的雏鸡发生率高，死亡率可达80%以上。耐过的雏鸡生长缓慢，发育不良。成鸡多为带虫者，增重量和产蛋受到一定影响。

1 流行病学

球虫的宿主有特异性，即侵袭鸡的球虫不会侵袭火鸡等其他家禽，而感染其他家禽的球虫不会感染鸡。各品种的鸡均有易感性，一日龄雏鸡对本病也敏感，但有母源抗体保护，所以，10日龄以内很少发病。15～50日龄发病率和死亡率很高，成年鸡对球虫也是敏感的。球虫的卵囊抵抗力非常强，在土壤中可以保持生活期达4～9个月，在有树荫的运动场上，可达15～18个月。当气温在22℃～30℃时一般只需要18～36 h，就可能成为感染性卵囊。卵囊对高温和干燥的抵抗力较弱。病鸡是主要传染源。凡被带虫鸡污染过的饲料、饮水、土壤或用具等，都有卵囊存在；鸡感染球虫的途径主要是吃了感染性卵囊；人及其衣服、用具等可以成为机械性传播者。苍蝇、甲虫、蟑螂、鼠类和野鸟都可成为机械传播媒介。当存有带虫鸡（传染源）并有传染性卵囊时，就会爆发球虫病。发病时间与气温、雨量有密切关系，通常在温暖的月份流行。室内温度高达30℃～32℃，湿度80%～90%时，最易发病。外界环境和饲养管理，对球虫病的发生有重大关系。天气潮湿多雨，雏鸡过于拥挤，运动场积水，饲料中缺乏维生素A、维生素K以及日粮配备不当等，都是本病流行的诱因。

2 临床症状

（1）急性型：急性型病程为2～3周，多见于雏鸡。发病初期精神沉郁，羽毛松乱，不爱活动；食欲废绝，鸡冠及可视黏膜苍白，逐渐消瘦；排水样稀便，并带有少量血液。若是盲肠球虫，则粪便呈棕红色，以后变成血便。雏鸡死亡率高达100%。

（2）慢性型：慢性型多见于2日龄～4月龄的雏鸡或成鸡，症状类似急性型，但不大明显。病程也较长，拖至数周或数月。病鸡逐渐消瘦，产蛋减少，间歇性下痢，但较少死亡。

3 材料与方法

3.1 卵囊的分离与纯化

以1×104/鸡的剂量分别经口感染两周龄的无球虫鸡，进行大量繁殖，感染后7～8 d扑杀柔嫩艾米尔球虫感染鸡，取其盲肠和粪便。盲肠用组织粉碎机打碎，调 pH2.0，按2mg/ml的剂量加入胃蛋白酶，在39℃恒温水箱消化1h，使卵囊尽量充分游离出来。粪便同消化好的盲肠依次200目、300目、400目铜筛过滤，滤液3 000 rpm，10 min沉淀，弃去上清液，在沉淀中加入1.1 mol/L蔗糖溶液再次3 000 rpm离心5 min，离心管上层漂浮的白色塞子状物即为卵囊，将卵囊捞入小于0.5 mol/L蔗糖溶液中，离心沉淀充分洗涤，除去比卵囊小的杂质，最后加入5%次氯酸纳，在4℃作用10min，反复充分洗涤除去NaOCl和小杂质，即得到纯化的未孢子化卵囊，备用。

3.2 GSNO的配制 按Stefan F介绍的方法[4]

3.3 卵囊的处理

3.3.1 未孢子化卵囊处理

取未孢子化卵囊用GSNO处理，另取等量的未孢子化卵囊作为对照

3.3.2 孢子化卵囊的处理

用常规方法将卵囊孢子化，使得孢子化率达90%以上，分为两部分，一部分用GSNO处理，一部分作为对照

3.3.3 将药物处理过的卵囊离心去除GSNO，用PBS清洗3次。

3.3.4 将以上处理过的卵囊浓缩至2.0×107/ml，移入Ependorf管中，分别加入10ulDTT、10ulPMSF、10ulEDTA，加入PBS至终体积为1ml。将盛有浓缩卵囊的离心管置于冰浴中，用DYNATEC超声波裂解器打碎卵囊，相对输出功率为20%，每循环99下，共8个循环，直至镜检无完整卵囊为止，而后用低温超速离心机，4 ℃，15 000 rpm，离心30 min，取上清液分别装于0.5 ml离心管中，冷藏备用（最好马上应用）。

3.4 电泳试剂的配置

凝胶：分别配制5.6%和7%分离胶，见附录

（1）1mol/l HCl 48.0ml TEMED 36.6g Tris 0.23ml

（2）Acr 28.0g Bis 0.735g

（3）过硫酸胺 0.14g

（4）1mol/l HCl 48.0mlTris 5.98g TEMED 0.46ml

（5）Acr 10.0g Bis 2.5g

（6）核黄素 4.0mg

（7）蔗糖 40.0g

①7%分离胶 1份1号，3份2号，4份3号②5.6%分离胶2份1号，1份2号，2份3号

③5%浓缩胶1份4号，4份5号，1份6号，2份7号

3.5 电泳操作方法

3.5.1 制 胶

装好电泳槽，在梳子下端的玻璃板处作一标记。用熔化状态的1%琼脂封板，将现配置的聚丙酰胺凝胶迅速注入玻璃板内，切勿产生气泡。然后在胶面上轻铺一层1cm高的水层，室温下进行聚合，出现明显的界面后，滤纸吸掉水层，灌入浓缩胶5%，插入梳子，室温下聚合1h。待聚合后拨出梳子，用去离子水冲洗加样孔，充分洗涤干净，加满电极缓冲液待用

3.5.2 电泳

用pH8.0，0.05mol/l Tris-甘氨酸作电极缓冲液，以0.01溴酚兰作指示剂，恒压160伏电泳，溴酚兰至板底1cm高时，停止电泳。

3.5.3 保温显色

电泳完毕后，取出胶版放入大平皿中，注入新鲜配置的酶显色液，置于37℃温箱避光保存60 min至过夜，待酶带出现后，洗掉显色液，加入酶固定液固定24 h，观察结果拍照和绘制图谱。

4 结果

4.1 卵囊分离纯化及孢子化情况

图1 未孢子化卵囊

图2 孢子化卵囊

4.2 电泳及活性染色结果

图3 LDH同工酶谱

图4 G-6-PD同工酶谱

a为GSNO处理过的孢子化卵囊 A为GSNO处理过的孢子化卵囊

b为GSNO处理过的未孢子化卵囊 B为GSNO处理过的未孢子化卵囊

c对照组的孢子化卵囊. C对照组的孢子化卵囊

d对照组的未孢子化卵囊. D对照组的未孢子化卵囊

非变性PAGE对照结果表明：GSNO处理未孢子化及孢子化卵囊，均不能影响与球虫有氧代谢中乳酸脱氢酶（LDH）、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G-6-PD）的活性，药物处理与对照之间的电泳图谱一致，说明GSNO对球虫的影响力表现在其他某些方面。

5 治疗

治疗球虫病的药物很多，常用的药物包括：氨丙啉：氨丙啉毒性小，预防量为饲料添加40～250 mg/kg，连用7 d，随后将浓度减半，再用14 d。磺胺二甲氧密啶比磺胺二甲氧密啶毒性小，预防量为饲料或饮水中加入0.05%连用6d；治疗量为预防量的倍量混饲或饮水连续3～7d。氯苯胍 氯苯胍反应小，饲料拌入35g/t混匀，连喂1～2个月。磺胺喹恶啉以间断投药治疗为佳，0.1%混饲2～3d，停3d再用0.05%混饲2d。速丹（常山酮）速丹用量为3mg/ kg浓度混饲。

6 预防

鸡舍要保持清洁干燥、通风良好，及时清除粪便及潮湿的垫料。饲槽、饮水器、用具和栖架要经常洗刷和消毒，减少感染机会。饲料中应保持有足够的维生素A和维生素K，以增强抵抗力，降低发病率。

7 讨论

GSNO能完全抑制球虫卵囊的孢子化过程，而孢子化过程是一有氧呼吸过程，通过该实验排除了GSNO对与呼吸有关LDH及G-6-PD活性抑制的可能性。

作为一种内源性信号分子，GSNO是一种舒血管物质，在与电子传递链中的血红素作用过程中降低了呼吸活性，可导致细胞代谢率下降，影响线粒体的渗透性。

资料表明，NO可直接或间接地抑制线粒体的活性，表现在如下方面：

（1）细胞色素c氧化酶活性受到抑制：细胞色素c氧化酶之所以被NO抑制是由于Fe与NO结合成加合物，从而失去活性。

（2）在NO作用下乌头酸酶形成二亚硝酰加合物，从而失去酶活性。

综上所述，GSNO对球虫卵囊孢子化过程的抑制作用与线粒体呼吸过程有着密切的关系，在线粒体呼吸方面与GSNO作用关系的研究有着更为广阔的前景，需要科研工作者不断深入探讨。

[1] 孔繁瑶.家畜寄生虫学[M].北京：中国农业出版社，1991.

[2] 李德昌.畜禽球虫病及其防治[M].北京：金盾出版社，2003 .

[3] Biggs PM.The world of poultry disease[J].Avian Pathol，1982，（11）：281-300.