检测GPC3和GP73两种方法的比较及与临床的相关性

马 洁，汪顺才，朱梦琪，马久明，周 华，虞腊青，杨永峰，经继生

检测GPC3和GP73两种方法的比较及与临床的相关性

马 洁1，汪顺才2，朱梦琪3，马久明2，周 华2，虞腊青2，杨永峰4，经继生2

摘要采用ELISA法检测70例标本（肝癌组39例、肝硬化组31例）血清中磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（GPC3）和高尔基体蛋白73（GP73）的水平，qRT-PCR法检测相同标本外周血单个核细胞（PBMC）中GPC3 mRNA和GP73 mRNA的相对表达量。结果显示肝癌组血清中GPC3和GP73表达量显著高于肝硬化组（P＜0.0 001）；两组间PBMC中GPC3 mRNA和GP73 mRNA水平差异无统计学意义；相关性分析结果显示，肝硬化组和肝癌组血清中GPC3、GP73含量均有正相关性（P＜0.01）。血清中GPC3和GP73的水平均能预测原发性肝癌，且GPC3和GP73的水平具有一定的相关性；PBMC中GPC3 mRNA和GP73 mRNA的表达水平不能很好的区分肝癌组与肝硬化组，提示ELISA法检测血清中GPC3和GP73的表达水平是临床预测原发性肝癌的首选方法。

关键词原发性肝癌；高尔基体蛋白73；磷脂酰肌醇蛋白聚糖3；ELISA法；qRT-PCR法

2015-02-02接收

作者单位：1江苏大学医学院临床生化检验系，镇江 212013

2江苏省句容市人民医院感染病科，句容 212400

3复旦大学附属华山医院传染科肝病研究室，上海200040

4南京市第二医院肝内科，南京 156500

原发性肝癌（primary hepatocellular carcinoma，HCC）在我国发病率逐年上升，目前常规甲胎蛋白（alpha fetaprotein，AFP）和超声的检查筛选方法敏感性、特异性均不能令人满意；很多HCC患者临床诊断时已失去有效的治疗机会。近年来，各种有希望的新的肿瘤标志物被相继发现，磷脂酰肌醇聚糖-3（glypican3，GPC3）是肝癌的一种新的组织化学标志物［1］。高尔基体蛋白73（Golgi protein 73，GP73）可作为肝癌潜在独立的诊断指标，如与AFP联合检测可提高肝癌的诊断效率［2-3］。该研究通过ELISA法检测血清中GPC3和GP73的蛋白表达水平以及qRT-PCR法检测外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）中GPC3、GP73 mRNA的表达水平，比较两者在诊断HCC中的应用价值，用以判断哪一种方法是临床预测原发性肝癌的首选方法。

1　材料与方法

1.1 病例资料 收集2012年12月～2013年12月

句容市人民医院与南京市第二医院就诊的70例患者（肝癌组39例、肝硬化组31例），诊断参照2000年病毒性肝炎防治方案［4］。肝癌的诊断参照2011年原发性肝癌诊断规范［5］。

1.2 观察指标 血清中GPC3、GP73的表达水平；PBMC中GPC3、GP73 mRNA的表达水平。

1.3 入选与排除标准 均为乙型或丙型肝炎肝硬化患者，无其它肝炎病毒重叠感染，无自身免疫性肝炎重叠感染，丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）和天门冬氨酸氨基转移酶（aspartate transaminase，AST）水平正常或异常，心、肺、肾功能正常。

1.4 方法

1.4.1 主要试剂及仪器 ALT、AST检测采用美国贝克曼公司自动生化仪；逆转录试剂盒FSQ-101（日本Toyobo公司）；荧光定量试剂盒SYBRPremix Ex TaqTMⅡ（日本TaKaRa公司）；GPC3、GP73 ELISA检测试剂盒（上海博研生物科技有限公司）。

1.4.2 ELISA法检测GPC3、GP73表达水平 在ELISA板中加入准备好的稀释样品和标准品，37℃反应30 min，洗板5次，每次5 min；加入酶标试剂，37℃反应30 min，洗板5次，每次5 min；加入显色液A、B，37℃显色10 min后加入终止液，15 min之内读取光密度（optical density，OD）值。以标准品的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度，再乘以稀释倍数（×5）；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数（×5），即为样品的实际浓度。

1.4.3 qRT-PCR法检测GPC3、GP73 mRNA表达操作步骤：①PBMC的分离。取2 ml全血置于EDTA抗凝剂的试管中，加入等体积的PBS溶液混匀。另准备一个干净的10 ml离心管，加入4 ml人淋巴细胞分离液，在人淋巴细胞分离液面上1 cm处沿管壁徐徐加入血液与PBS的混合液。切记勿破坏液体界面。1 500 r／min离心20 min后，小心吸取云雾状白膜层，即为PBMC。②将PBMC抽提总RNA后，逆转录合成cDNA，最后进行目的基因PCR扩增。GPC3、GP73及β-actin qRT-PCR引物由本实验室设计，上海生物工程有限公司合成。GPC3引物F：5′-GCCCATTCTCAACAACGC-3′；R：5′-CACT TTCAAACCCTTCCTCAT-3′；GP73 F：5′-CAGCGCT GATTTTGAGATG-3′；R：5′-ATGATCCGTGTCTGGAG GTC-3′）；β-actin F：5′-CGTACCACTG GCATCGT GAT-3′；R：5′-GTGTTGGCGTACAGGTCTTT G-3′。

1.5 统计学处理 使用SPSS 19.0统计软件，计量数据用±s表示，性别采用χ2检验进行比较，年龄、ALT、AST采用Student’s t检验进行比较。

2　结果

2.1 病例基本情况 70例入选本研究的肝癌与肝硬化患者在性别、年龄上差异无统计学意义，两组病例的临床特征具有可比性，见表1。

表1　病例基本情况（n，±s）

表1　病例基本情况（n，±s）

项目　　肝癌组（n＝39）肝硬化组（n＝31）　t／χ2值　P值性别（n）男30　18　2.850　0.09 女9 13年龄（岁）　46.2±10.1　49.2±10.3　1.224　　＞0.05 ALT（U／L）　105.2±15.2　104.2±13.1　0.290　　＞0.05 AST（U／L）128.2±23.8　116.2±30.1　1.863　　＞0.05

2.2 血清中GPC3和GP73的表达 两组患者血清中GPC3、GP73的检测值比较，肝癌组：GPC3 （15.8±3.86）μg／L、GP73（107.46±29.5）ng／ml，肝硬化组：GPC3（7.51±1.38）μg／L、GP73（65.09 ±17.23）ng／ml。由此可见，肝癌组GPC3、GP73的检测值高于肝硬化组（t＝20.77，P＜0.000 1），同时GP73的检测值也高于肝硬化组（t＝8.405，P＜0.000 1）。见图1。

2.3 PBMC中GPC3、GP73 mRNA的表达水平两组患者PBMC中GPC3、GP73 mRNA的表达量比较，肝癌组：GPC3（16.94±8.67）μg／L、GP73（12.51 ±2.97）ng／ml，肝硬化组：GPC3（15.63±7.35）μg／L、GP73（14.25±3.67）ng／ml。肝癌组GPC3、GP73 mRNA的表达量与肝硬化组比较差异无统计学意义。见图2。

2.4 ELISA法检测血清中GPC3、GP73含量的相关性 将肝硬化组血清中GPC3、GP73含量做相关性分析，结果显示，两种指标的相关系数r＝0.669 4，有显著的正相关性（P＜0.000 1）；肝癌组血清中两种指标的相关系数r＝0.464 5，有显著的正相关性（P＝0.002 9）。见图3。

3　讨论

GPC3和GP73是近年来发现的与HCC密切相关的指标，GPC3是1995年发现的细胞外糖蛋白，是一种肿瘤抑制物质，可以调节细胞增殖［6］。正常人肝组织中不表达，提示可能在肝脏功能中发挥着重要作用［7］。研究［8-9］显示在常规肿瘤标志物未达到诊断水平的肝癌以及比较小的肝脏肿瘤的诊断中，GPC3可以起到很好的互补作用，同时GPC3的表达异常也用于HCC转移的监测。GP73是Kladney et al［10］发现的一个高尔基体二型跨膜蛋白，该研究发现GP73的表达与肝纤维化的严重程度成正相关性（肝纤维化的程度越重，GP73表达越高），患者从肝硬化发展成原发性肝癌时GP73的表达达到高峰，可以推测GP73高表达可能与肝癌的发生和发展有关。Block et al［11］首先提出，在肝癌患者血清中，GP73水平显著升高。

本研究中，ELISA法结果显示，肝癌组血清中GPC3和GP73的含量均显著高于肝硬化组，且两组中GPC3和GP73两个指标之间均有显著的正相关性，提示可以根据GPC3和GP73的水平作为诊断原发性肝癌的临床指标。qRT-PCR法结果显示，根据PBMC中GPC3 mRNA和GP73 mRNA的表达水平无法区分肝癌组和肝硬化组。qRT-PCR法所需的检测标本—PBMC较难获得，整个操作过程技术条件要求高，费用昂贵，不适宜基层医疗单位开展。相

比较而言，ELISA法简单，所需检测标本（血清）比较容易获得，患者所付出费用明显降低，同时对基层医疗单位设备的要求可操作性也低。

参考文献

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［11］Block T M，Comunale M A，Lowman M，et al.Use of targeted glycoproteomics to identify serum glycoproteins that correlate with liver cancer in woodchucks and humans［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2005，102（3）：779-84.

Comparing two detection methods of GPC3 and GP73 and the correlation with clinic

Ma Jie1，Wang Shuncai2，Zhu Mengqi3，et al
（1School of Medicine，Jiangsu University，ZhenJiang 212013；2Dept of Infectious Diseases，Jurong People′s Hospital，Jurong 212400；3Dept of Infectious Diseases Liver Research，Huashan Hospital of Fudan University，Shanghai 200040）

AbstractELISA and qRT-PCR were used to detect the level of glypican3（GPC3）and Golgi protein 73（GP73）of 70 patients［primary hepatocellular carcinoma（HCC）group 39 patients and cirrhosis group 31 patients］in serum and peripheral blood mononuclear（PBMC）respectively.The results showed that the expression levels of GPC3 and GP73 in serum had significant difference between two groups（P＜0.001），but the relative expression of GPC3 and GP73 mRNA in PBMC had no great difference.Correlation analysis showed that the expression levels of GPC3 and GP73 in serum were positively correlated（P＜0.01）.In conclusion，the expression levels of GPC3 and GP73 in serum can predict HCC，and the levels of GPC3 and GP73 have some relevance.GPC3 and GP73 mRNA levels in PBMC can′t distinguish between two groups，suggesting ELISA is the preferred method of clinical to detect the expression levels of GPC3 and GP3 in serum of HCC.

Key wordsHCC；GPC3；GP73；ELISA；qRT-PCR

作者简介：马 洁，女，博士，副教授，硕士生导师，责任作者，E-mail：jsdxmajie＠163.com；经继生，男，副教授，硕士生导师，责任作者，E-mail：jrjjs2008＠sina.com

基金项目：江苏省卫生厅自然科学基金项目（编号：Y201311）；江苏大学临床科技发展基金项目（编号：JLY20120103）

文献标志码A

文章编号1000-1492（2015）05-0707-04

中图分类号R 512