miR-98对肝癌HepG2细胞增殖、凋亡以及侵袭、迁移能力的影响

高 爽，李文成，刘加涛，于瀚卿，范璐璐，孙国平

miR-98对肝癌HepG2细胞增殖、凋亡以及侵袭、迁移能力的影响

高 爽，李文成，刘加涛，于瀚卿，范璐璐，孙国平

摘要目的 研究miR-98对肝癌HepG2细胞增殖、凋亡和侵袭、迁移能力的影响及其可能机制。方法 将miR-98mimics、mimics-NC、miR-98inhibitor、inhibitor-NC瞬时转入肝癌HepG2细胞内，应用噻唑盐（MTT）法、流式细胞仪、Transwell小室实验检测miR-98对肝癌HepG2细胞增殖、凋亡以及侵袭、迁移能力的影响，进一步用Western blot法检测各组Bcl-2蛋白的表达水平。结果 MTT实验表明miR-98过表达后，肝癌细胞的增殖能力明显低于对照组；Annexin VFITC／PI凋亡实验证实上调miR-98表达后，细胞的凋亡率较对照组升高；Transwell小室实验表明上调miR-98可使肝癌细胞的侵袭、迁移能力减弱。而当miR-98被抑制后，肝癌HepG2细胞的增殖及侵袭、迁移能力则明显增强，凋亡率则下降。Western blot实验检测发现miR-98过表达后，Bcl-2的表达降低。结论 miR-98可能在肝癌的发生、发展中发挥着抑癌基因的作用；miR-98可能通过下调Bcl-2的表达，促进肝癌HepG2细胞凋亡。

关键词miR-98；HepG2；增殖；凋亡；侵袭；迁移

2015-02-02接收

作者单位：安徽医科大学第一附属医院肿瘤科，合肥 230001

原发性肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是世界范围内常见的恶性消化系统肿瘤之一，在我国尤为高发［1］，目前手术切除仍是主要的治疗手段，但手术切除风险高、有效率低，且肝癌对放疗不敏感，全身化疗总体有效率也＜10%，因此，发现新的诊断标志物和治疗靶点已经成为探索肝癌治疗和预后的关键［2-3］。

自Murakami et al［4］首次报道在原发性肝癌中微小RNA（microRNA，miRNA）表达异常以来，多项研究均证实了miRNA的异常表达与原发性肝癌的发生发展密切相关，因此深入研究miRNA在HCC中的功能及相关作用机制，或许能为HCC的治疗提供新的途径。该研究通过建立瞬时转染模型改变HepG2细胞中miR-98的表达水平，观察miR-98对 HepG2细胞生物学行为的影响，初步探讨miR-98在肝癌的发生发展中发挥的作用，为寻找新的分子靶向治疗靶点奠定理论基础。

1　材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系 肝癌HepG2细胞株购自中国科学院上海生命科学院。

1.1.2 主要试剂 miR-98mimics、miR-98mimics阴性对照（mimics-NC）、miR-98inhibitor、miR-98inhibitor阴性对照（inhibitor-NC）、转染试剂Lipofectamine3000、RNA提取试剂TRIzol以及逆转录所需相关试剂均购自美国Invitrogen公司，miR-98 Taqman探针荧光定量试剂盒、U6 Taqman探针荧光定量试剂盒购于上海生工生物有限公司，MTT、抗βactin多克隆抗体、抗Bcl-2多克隆抗体、山羊抗兔二抗、山羊抗小鼠二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司；Annexin V-FITC细胞双染凋亡试剂购自上海贝博公司。

1.1.3 主要仪器设备 Acpo-6100 CO2培养箱（美国DuPont公司）；YJ-1450型医学净化工作台（苏州净化设备公司）；倒置式显微镜、正置荧光显微镜（日本Olympus公司）；普通PCR仪K960（杭州晶格科学仪器有限公司）；PIKOREAL96荧光定量PCR仪（美国Thermo公司）；Elx-800型酶标仪（美国Bio-Tek仪器公司）；EPICS XL／XL-MCL流式细胞仪（美国Beckman Coulter公司）和ImageQuantTMLAS-4000型发光成像系统（日本通用电气医疗集团生命科学部）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与传代 将肝癌HepG2细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM培养液中，放置于37℃、5%CO2的培养箱内，隔天换液，待细胞融合度大于80%后进行传代，取对数生长期细胞用于实验。

1.2.2 建立瞬时转染模型 取生长状态良好并处在对数生长期的细胞，按照一定的细胞密度接种于细胞培养板中，培养24 h，待细胞贴壁后利用Lipofectamine3000为载体进行转染。实验分5组：只加培养基的空白对照组、miR-98mimics组、mimics-NC

组、miR-98inhibitor组以及inhibitor-NC组。

1.2.3 运用Taqman探针实时荧光定量聚合酶链式反应（PCR）测定转染效率 为了验证HepG2细胞在转染miR-98mimics、miR-98inhibitor后细胞内miR-98的表达是否发生相应地变化，转染24 h后，收集细胞，经过提取RNA，逆转录，进行Taqman探针实时荧光定量PCR，ΔCt＝CtmiR-98-CtU6，ΔΔCt＝（CtmiR-98-CtU6）转染组-（CtmiR-98-CtU6）空白对照组，组间miR-98的相对表达水平用2-ΔΔCt计算。

1.2.4 MTT法检测miR-98对肝癌HepG2细胞增殖的影响 取对数生长期的HepG2细胞，以5.0× 103个／孔的细胞密度接种于96孔板中，每孔100 μl，培养24 h，待细胞贴壁后，用Lipo-fectamine 3000转染。实验分5组，每组设5个复孔。转染48 h后，每孔按1∶10的比例加入MTT溶液，37℃培养箱避光孵育3～4 h后加入DMSO 150 μl／每孔，用酶标仪测定各孔在490 nm波长下吸光度（optical density，OD）值，并计算细胞存活率。细胞存活率（%）＝（OD实验组-OD空白组）／（OD对照组-OD空白组）× 100%。

1.2.5 流式细胞术检测细胞凋亡 将转染48 h后各组细胞以及只加培养液的空白对照组细胞消化离心，冰PBS溶液洗涤2次，每孔细胞用400 μl结合缓冲液重悬，滤入流式管后依次加入5 μl Annein V 和10 μl PI染液，上机检测，所有细胞分为4组，Q1：Annexin V-PI＋-坏死细胞；Q2：Annexin V＋PI＋-凋亡后继发坏死细胞；Q3：Annexin V＋PI--早期凋亡细胞；Q4：Annexin V-PI--存活细胞。细胞凋亡率（%）＝（Annexin V＋PI＋细胞数＋Annexin V＋PI-细胞数）／10 000×100%。

1.2.6 Transwell小室迁移实验 转染48 h后将miR-98mimics组、mimics-NC组、miR-98inhibitor组、inhibitor-NC组以及空白对照组细胞加胰酶消化，吹打成单细胞悬液，PBS溶液洗涤细胞2次后，无血清培养基重悬，调整细胞浓度为（1～2）×105个／ml，取100 μl接种于Transwell小室内，向下室加入500 μl含10%胎牛血清的培养基，37℃培养10～12 h，取出小室，用棉签轻轻擦掉小室内未穿过膜的细胞，用95%乙醇溶液固定15 min后以0.1%结晶紫染色10 min，PBS清洗2～3遍，空气中自然风干。将小室倒置于载玻片上，于正置荧光显微镜下随机选取5个（×200）视野计数穿过膜的细胞数并进行拍照。

1.2.7 Transwell小室侵袭实验 用无血清培养基按1∶7将基质胶稀释，取50 μl于每一个小室内，将铺好基质胶的小室放于37℃培养箱内放置4 h后方可使用。将各组细胞用胰酶消化后制成单细胞悬液，PBS洗涤细胞2次后，无血清培养基重悬，调整细胞浓度为（1～2）×105个／ml，取100 μl悬液缓慢滴入铺好基质胶的上室内，向下室加入500 μl含10%胎牛血清的培养基，37℃培养10～12 h，取出小室，用棉签轻轻擦掉未穿过膜的细胞，95%乙醇溶液固定15 min，0.1%结晶紫染色10 min，PBS清洗2 ～3遍，空气中自然风干。将小室倒置于载玻片上，于正置荧光显微镜下随机选取5个（×200）视野计数穿过膜的细胞数并进行拍照。

1.2.8 Western blot法观察凋亡蛋白Bcl-2的表达将转染后48 h各组细胞以及只加培养液的空白对照组细胞从培养箱中取出，冷PBS洗2遍，冰上裂解30 min后离心，取上清液，采用BCA法蛋白定量后；加入5×蛋白上样缓冲液，沸水煮10 min，室温下冷却后置于-20℃保存；实验时经过电泳分离蛋白、转膜、封闭、洗膜等操作后，一抗4℃孵育过夜。次日，二抗室温孵育2 h，最后加入电化学发光试剂，利用ImageQuantTMLAS-4000型发光成像系统检测蛋白荧光信号并显像，采用Image J软件分别测量Bcl-2和β-actin条带的积分光密度值，以Bcl-2／β-actin的值来反映Bcl-2的相对表达量。

1.3 统计学处理 应用SPSS 16.0统计软件进行分析，数据以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析和LSD法。

2　结果

2.1 转染后HepG2细胞内miR-98表达水平的变化 转染24 h后，以空白对照组的表达量为基准，2-ΔΔCt计算相对表达水平，结果发现miR-98mimics组细胞内miR-98的表达量约为空白对照组的（34.81±4.80）倍，而miR-98inhibitor组细胞内miR-98的表达量约为空白对照组的（0.33±0.03）倍，表明转染miR-98mimics可有效上调HepG2细胞内miR-98的表达水平，而转染miR-98inhibitor则能有效下调miR-98的表达，为后续进一步试验奠定了基础，见图1。

2.2 miR-98对肝癌HepG2细胞增殖的影响 转染48 h后，空白对照组、miR-98mimics组、mimics-NC组、miR-98inhibitor组及inhibitor-NC组之间细胞存活率差异有统计学意义（F＝28.005，P＜0.05）。miR-98mimics组与空白对照组、mimics-NC组相比，细胞存活率分别下降24.31%、20.07%（P＜0.05）；而miR-98inhibitor组与空白对照组、inhibitor-NC组相比，细胞活力升高，细胞存活率分别升高15.37%、16.47%（P＜0.05）；而空白对照组、mimics-NC组、inhibitor-NC组间细胞存活率间差异均无统计学意义。以上结果表明，上调miR-98表达可抑制细胞活力，降低细胞存活率，见图2。

2.3 miR-98对肝癌HepG2细胞凋亡的影响 转染48 h后，空白对照组、miR-98mimics组、mimics-NC组、miR-98inhibitor组及inhibitor-NC组之间细胞凋亡率差异有统计学意义（F＝211.81，P＜0.05）。miR-98mimics组细胞凋亡率显著高于空白对照组、mimics-NC组（P＜0.05）；miR-98inhibitor组细胞凋亡率则低于空白对照组以及inhibitor-NC组（P＜0.05）；mimics-NC组、inhibitor-NC组细胞凋亡率高于空白对照组（P＜0.05），见图3。

2.4 miR-98对肝癌HepG2细胞迁移能力的影响空白对照组、miR-98mimics组、mimics-NC组、miR-98inhibitor组及inhibitor-NC组之间细胞穿膜数差异有统计学意义（F＝67.02，P＜0.05）。过表达miR-98的肝癌细胞穿入到下层小室的数目与空白对照组、mimics-NC组相比分别减少44.11%、39.40%（P＜0.05）。而将miR-98干扰后，穿入到下层小室的肝癌细胞数目明显多于空白对照组以及inhibitor-NC组，分别增加80.83%、101.8%（P＜0.05），但空白对照组、mimics-NC组、inhibitor-NC组间穿膜细胞数差异无统计学意义（P＞0.05），见表1、图4。

2.5 miR-98对肝癌HepG2细胞侵袭能力的影响空白对照组、miR-98mimics组、mimics-NC组、miR-98inhibitor组及inhibitor-NC组之间细胞穿膜数差异有统计学意义（F＝42.40，P＜0.05）。miR-98mimics组细胞穿过基质胶进入到下层小室的数目与空白对照组、mimics-NC组相比分别减少59.83%、57.60%（P＜0.05）。miR-98inhibitor组细胞穿过基质胶进入到下层小室的肝癌细胞数目明显

多于空白对照组以及inhibitor-NC组，分别增加73.80%、88.62%（P＜0.05），但空白对照组、mimics-NC组、inhibitor-NC组间穿膜细胞数差异无统计学意义（P＞0.05），见表1、图5。

表1　各组中Transwell侵袭迁移实验穿膜细胞数（个／HP,±s）

表1　各组中Transwell侵袭迁移实验穿膜细胞数（个／HP,±s）

与空白对照组比较：*P＜0.05；与mimics-NC组比较：＃P＜0.05；与inhibitor-NC组比较：ΔP＜0.05

组别　　迁移　　侵袭空白对照100.2±10.640　45.8±9.039 mimics-NC　92.4±7.128　43.4±8.792 miR-98mimics　56.0±11.235*＃　18.4±4.393*＃miR-98inhibitor　181.2±16.634*＃Δ　79.6±7.893*＃Δinhibitor-NC　89.8±15.385　42.2±6.419

2.6 凋亡相关蛋白Bcl-2的表达水平 Western blot法检测显示，转染48 h后，miR-98mimics组Bcl-2的表达水平明显低于空白对照组、mimics-NC组（P＜0.05）。miR-98inhibitor组Bcl-2的表达水平明显高于空白对照组以及inhibitor-NC组（P＜0.05），但空白对照组、mimics-NC组、inhibitor-NC组间Bcl-2的表达量差异无统计学意义（P＞0.05），见图6。

3　讨论

miRNA是一类长度为21～25个核苷酸组成的非编码单链小分子RNA，广泛存在于各种动植物中，抑制靶mRNA翻译，对基因进行转录后翻译和表达的调控，进而参与生物体的生长发育及多种生理病理学过程的调控，包括细胞分化、增殖、凋亡。诸多肝癌相关的研究［5］表明，多种miRNA可通过调控不同的癌基因和抑癌基因的表达实现对肝癌发生发展过程的调控，包括肝癌细胞的增殖、凋亡、侵袭转移等。

let-7家族已经被证实在肝癌组织中表达下调［6］，let-7可通过下调c-myc和上调p16（Ink4a）的表达抑制肝癌细胞增殖［7］，还可通过抑制Bcl-2表达来增强索拉非尼诱导的细胞凋亡［8］，此外，let-7对肝癌的转移有明显的抑制作用，与患者的生存期紧密相关［9］。miR-98是let-7家族的一员，研究［10］证实miR-98可靶向抑制ALK4、MMP11的表达，进而抑制乳腺癌细胞增殖、侵袭以及血管生成。在人耐顺铂肺腺癌细胞株A549／DDP中，过表达的miR-98可以上调HMGA2的表达来增加肺腺癌细胞对顺铂的敏感性［11］。但目前国内仍未有miR-98对肝癌

HepG2细胞系增殖及侵袭能力影响的报道。本研究结果表明上调肝癌HepG2细胞内miR-98的表达，可以抑制细胞的增殖，促进细胞凋亡，减弱细胞的侵袭迁移能力，对于相关机制，本研究也进行了初步的探索，结果发现，miR-98可能通过下调Bcl-2的表达促进HepG2细胞的凋亡。

Bcl-2属于Bcl-2家族，是一种抗凋亡基因Bcl-2家族在线粒体凋亡信号的调控中发挥着重要作用。研究［12-13］表明在HCC中miRNA主要通过Bcl-2家族来影响细胞凋亡。miR-125b通过抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达促进细胞凋亡；miR-221则可抑制Bmf的表达发挥抗凋亡的作用；miR-122也能通过抑制Bcl-w的表达抑制凋亡；此外miR-224也可通过直接调节Bcl-2的表达发挥抗凋亡的作用［14-15］。且已有相关研究［11］表明在人肺腺癌细胞中，上调miR-98的表达后，可引起Bcl-2、Bcl-xL的表达下调进而促进细胞凋亡，因此本研究对改变miR-98的表达后HepG2细胞内Bcl-2的表达水平进行进一步观察，Western blot结果显示，上调miR-98表达后，可引起Bcl-2表达下调，抑制miR-98的表达，Bcl-2表达上调，表明miR-98可能通过下调Bcl-2的表达，促进细胞凋亡。

综上所述，本研究证实miR-98在肝癌的发生发展过程中发挥着抑癌基因的作用，但是miR-98影响这些生物学行为相应的靶基因、信号通路仍需进一步研究。

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Effect of miR-98 on proliferation，apop tosis，invasion and migration of hepatocellular carcinoma HepG2 cells

Gao Shuang，Li Wencheng，Liu Jiatao，et al
（Dept of Oncology，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230001）

AbstractObjective To investigate the potential mechanism of miR-98’s effects on proliferation，apoptosis，and invasion／migration of HepG2 hepatocellular carcinoma（HCC）cells.Methods miR-98mimics，mimics-NC，miR-

98 inhibitor and inhibitor-NC were transiently transfected into HepG2 cells.Effects of miR-98 on proliferation，apoptosis，invasion／migration of HepG2 cells were determined by MTT assay，flow cytometer，and Transwell assay.Western blot was then performed to determine Bcl-2 expression levels in each group.Results MTT assay demonstrated that proliferation rate of HepG2 cells in miR-98 overexpressing group was significantly lower compared with control groups.Annexin V-FITC／PI revealed that apoptosis was more prominent in miR-98 overexpressing group compared with control groups.Transwell assay revealed that invasion and migration were significantly attenuated in miR-98 overexpressing group compared with control groups.Western blot demonstrated that Bcl-2 expression level was lower in miR-98 overexpression group compared with control groups.Conclusion miR-98 serves as a suppressor in the development of HCC；miR-98 promotes apoptosis of HCC cells by down regulating expression of Bcl-2.

Key wordsmiR-98；HepG2；proliferation；apoptosis；invasion；migration

作者简介：高 爽，女，硕士研究生；孙国平，男，教授，主任医师，博士生导师，责任作者，E-mail：sunguoping＠ahmu.edu.cn

基金项目：国家自然科学基金（编号：81272739）；安徽省科技攻关项目（编号：12010402122）

文献标志码A

文章编号1000-1492（2015）05-0594-06

中图分类号R 735.7