实时荧光PCR技术检测饲料中沙门氏菌的应用研究

杨美荣马超越

(焦作市畜产品质量安全监测中心,河南焦作 454003)

实时荧光PCR技术检测饲料中沙门氏菌的应用研究

杨美荣*马超越

(焦作市畜产品质量安全监测中心,河南焦作 454003)

本研究建立了以DNA为基础的荧光定量PCR方法对饲料中的沙门氏菌进行检测，分别对两种非沙门氏菌菌种进行荧光PCR检测，结果均为阴性，表明本方法特异性强；并通过对空白饲料、人工污染饲料和自然感染饲料进行荧光PCR检测和国标方法检测相比较，结果均与国标方法相一致，且可以大大缩短检验时间。

饲料 沙门氏菌 荧光定量PCR

沙门氏菌是一种严重威胁人类及动物生命健康的人畜共患的肠道病原菌，可引起人和动物急性胃肠炎、伤寒、败血症以及肠外灶性感染等[1]。在世界各国的各类细菌性食物中毒中，沙门氏菌引起的食物中毒常高居榜首。由于沙门氏菌很容易在自然环境及动物体内存活和增殖，而且饲料原料（包括动物性及植物性原料）、饲料的粉碎加工及打包过程中都会引进沙门氏菌而污染饲料。因此准确快速地检测饲料中的沙门氏菌，不仅是发展畜牧业的需要，而且是减少人类沙门氏菌中毒的需要，对于畜禽健康、食品安全以及公共卫生都具有重要的意义。

目前，沙门氏菌的检测大都沿用传统的细菌培养、生化反应、血清学实验等方法，费时费力，从分离到鉴定需4-7d，而且操作烦琐，难以适应快速简便的要求，因此，有必要建立快速灵敏的检测方法为保障食品安全提供有效的检测工具。聚合酶链式反应（PCR）是近十多年来应用最广的分子生物学方法，黄金林等[2]建立了应用PCR进行沙门氏菌快速检测的方法。目前，常规PCR方法已经衍生出许多新的PCR检测技术如多重PCR检测技术、反转录PCR和实时荧光定量PCR等，并越来越多的应用于沙门氏菌的检测与鉴定。实时荧光PCR法在进出口食品检测中已有应用，但在饲料微生物的检测中应用很少。本研究建立了以DNA为基础的荧光定量PCR方法，并对来自焦作市的饲料进行了沙门氏菌检测，为预防食源性沙门氏菌感染提供借鉴材料。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂、仪器设备

1.1.1 被检材料

10批空白畜禽饲料样品，3批自然污染饲料样品，均来自焦作市随机抽检饲料；沙门氏菌菌种由河南省畜产品质检中心提供。

1.1.2 主要试剂

缓冲蛋白胨水增菌液（BP），氯化镁-孔雀绿增菌液（RV），均购自北京陆桥。沙门氏菌属荧光PCR检测试剂盒包括DNA提取液，沙门氏菌反应液，Taq酶，沙门氏菌阳性对照，阴性对照，购自深圳市易瑞生物技术公司；大肠杆菌阳性对照，金黄葡萄球菌阳性对照均购自深圳市易瑞生物技术公司。

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1.2 方法

1.2.1 前增菌和选择性增菌

取样品25g加入225ml缓冲蛋白胨水增菌液，混合均匀，36℃±1℃培养16～20h。移取0.1ml缓冲蛋白胨水增菌液加入10ml氯化镁-孔雀绿增菌液，36℃±1℃培养24h，增菌液备用。

1.2.2 模板DNA的提取制备

严格按照沙门氏菌属荧光PCR检测试剂盒说明操作。

（1）取增菌液1ml加到1.5ml无菌离心管中，12000rpm离心3min，弃去上清液；

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（2）加入50μl DNA提取液，充分混匀后沸水浴5min；

（3）13000rpm离心5min，取上清液进行检测或保存于-20℃以待检测。

1.2.3 实时荧光定量PCR检测

沙门氏菌实时荧光PCR反应总体系（25μl）包括22.6μl沙门氏菌反应液，0.4μl Taq酶，2μl DNA模板。对沙门氏菌进行实时荧光PCR反应参数见表1。分别以沙门氏菌属荧光PCR检测试剂盒中的沙门氏菌阳性对照和阴性对照作为实验的阳性对照模板和阴性对照。

表1 沙门氏菌荧光定量PCR反应参数

1.2.4 特异性

将沙门氏菌阳性对照、大肠杆菌阳性对照、金黄色葡萄球菌阳性对照、沙门氏菌阴性对照显著性差异，取出解冻，使用前2000rpm离心20s，向4个PCR反应管中分别加入22.6μl反应液、0.4μl Taq酶、2μl DNA模板（沙门氏菌阳性对照、大肠杆菌阳性对照、金黄葡萄球菌阳性对照、沙门氏菌阴性对照）；按表1 的参数分别进行荧光定量PCR检测，分析该方法的特异性。

1.2.5 饲料中沙门氏菌的检测

（1）人工污染饲料样品的检测

空白饲料10批，各取25g加入225ml缓冲蛋白胨水增菌液，用标准菌株接种，36℃±1℃培养16～20h，取前增菌液进行增菌培养、DNA提取、荧光定量PCR检测，同步用国标方法检测。

（2）空白饲料及自然污染饲料样品的检测

空白饲料10批，自然污染饲料3批各取25g进行前增菌和增菌培养、DNA提取、荧光定量PCR检测，同步用国标方法检测。

2 实验结果

2.1 特异性检测结果

沙门氏菌阳性对照、大肠杆菌阳性对照、金黄葡萄球菌阳性对照、沙门氏菌阴性对照分别进行荧光定量PCR扩增，试验结果见图1。结果显示仅沙门氏菌阳性对照检测到荧光信号，其他检测结果均为阴性，表明该方法有很强的特异性。

2.2 饲料中沙门氏菌的检测结果

（1）阴性添加饲料样品10批次进行荧光定量PCR扩增，检出10批次，同国标方法。

（2）空白饲料样品10批次进行荧光定量PCR扩增，检出0批次，同国标方法。

（3）自然感染饲料样品3批次进行荧光定量PCR扩增，检出3批次，同国标方法。

杨美荣，硕士研究生，从事畜产品质量安全检测工作，