生防放线菌的酶学特性及其代谢产物

李堆淑

(商洛学院 生物医药与食品工程学院， 陕西 商洛 726000)



生防放线菌的酶学特性及其代谢产物

李堆淑

(商洛学院 生物医药与食品工程学院， 陕西 商洛 726000)

为获得更多特异性各异的生防放线菌，采用皿内琼脂块法和试管斜面划线法，对从陕西省商洛市土壤分离的11株生防放线菌菌株(MX1，MX2，MX3，MX4，MX5，MX6，MX7，MX8，MX9，SY1，SY2)和供试细黄链霉菌进行生理生化试验。结果表明：有8株菌株产脂肪酶，SY1、MX1和细黄链霉菌的浑浊圈很明显，直径大于15 mm的菌株共计4株；有10株菌株产生卵磷脂酶，直径大于15 mm的菌株共计5株；有11株菌株对淀粉的水力较强，直径大于15 mm的共计6株；仅4株菌株可水解酪蛋白。12株供试菌株革兰氏染色均呈阳性；V-P试验，MX1、MX2和SY1呈阳性，MX6呈弱阳性；甲基红试验，MX2、MX3和细黄链霉菌呈阳性，MX9呈弱阳性；共有9株菌株可使明胶液化，占供试菌株的75%；仅SY2产纤维素酶，有3株菌株产过氧化氢酶；有2株菌株能使牛奶培养基凝固，4株菌株能使其胨化。

生防放线菌； 酶活性； 糖代谢； 商洛； 陕西

放线菌作为一类非常重要的生物物种，具有独特的生物学特性和功能。放线菌普遍存在于土壤和广泛分布在各种环境中，可产生特定的次级代谢产物，其产物具有新颖性、独特性和多样性。目前对生防放线菌的利用主要集中在抗生素方面。S-921是河北省微生物研究所分离的链霉菌(Streptomycesaureus)产生的抗生素，对苹果树腐烂病具有强烈的抑制作用[1]。张宇等[2]用放线菌A11菌株防治水稻稻瘟病效果显著。宋永燕等[3]报道，吸水链霉菌对水稻稻瘟病菌的抑菌率达92.2%。彭杰等[4]研究表明，海绵共附生放线菌(Streptomycessp.)A01059抗稻瘟病的效果较强。韦荣编等[5]报道，放线菌Z0604对人类病原菌的抗菌能力很强，并且抗肿瘤能力强。刘睿等[6]研究表明，海绵共附生放线菌(Saccharopolysporasp. nov)抗肿瘤也有显著成效。由于不同生态环境土壤中的生防放线菌种类与特性不同，也未见关于对陕西省商洛地区土壤中分离生防放线菌酶学特性及其代谢产物的研究报道。对此，笔者从该地区土壤中分离生防放线菌，从温度、pH、渗透压、氮源和碳源的适应性及代谢产物等方面研究分离菌的生理生化特征，以获得特异性各异的生防放线菌，为其商品化生产应用提供基础依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株 细黄链霉菌，商洛学院生物医药与食品工程学院微生物实验室提供；MX1、MX2、MX3、MX4、MX5、MX6、MX7、MX8、MX9、SY1和SY2生防放线菌，从陕西省商洛市苜蓿(简称MX)和三叶草(简称SY)土壤中分离的11株生防放线菌。

1.1.2 培养基

1)放线菌菌株培养基。改良高氏一号培养基[7]：KNO31.0 g、FeSO4·7H2O 0.01 g、K2HPO40.5 g、淀粉20.0 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、琼脂18.0 g、NaCl 0.5 g、蒸馏水1 000 mL，每300 mL培养基中加100 mg/kg的K2Cr2O71 mL。

2)生理生化特征测定的供试培养基和培养液。淀粉水解培养基[8]，明胶液化[9]培养基，卵黄琼脂培养基[10]，葡萄糖蛋白胨培养液[11]，吐温80培养基，酪蛋白水解培养基[12]，不含碳源的合成基础培养液[13]。

1.2 脂肪、淀粉、酪蛋白及纤维素水解试验

1.2.1 脂肪水解(吐温80) 参照文献[12]的方法进行，将待检菌株点接到吐温80培养基上，每皿3个相同菌株，25℃培养5～7 d，观察菌落周围是否有浑浊圈产生(产脂肪酶的菌株会分解油脂产生浑浊圈)，根据浑浊圈出现的早晚和浑浊圈的大小选出脂肪酶活性高的菌株。

1.2.2 淀粉水解 参照文献[9]的方法进行，将待检菌接种于淀粉培养基平板上，25℃培养7 d后在培养基表面加入碘液。如有淀粉酶产生，形成无色透明圈。

1.2.3 酪蛋白水解 参照文献[12]的方法进行，在酪蛋白水解培养基上点接放线菌菌株，25℃培养7 d后观察。根据菌落周围出现无色透明圈的早晚和大小反应该菌水解蛋白质能力的强弱。若菌落周围无透明圈出现则该菌株不能水解蛋白质。

1.2.4 纤维素水解 参照文献[10]的方法进行，配制适合放线菌生长而不含碳源的合成基础培养液，分装试管后，以新华一号滤纸作纤维素(碳源)，把其切成宽1 cm、长8 cm滤纸条，加入试管中，一半浸在液内，一半露在液外，将鉴定菌株接种在液外一段滤纸条上，于25℃培养30 d后观察。若该菌能将滤纸条分解成一团松散的纤维，或使之折断，碎裂成质状者为阳性，说明该菌株产生纤维素酶使之水解。反之，滤纸无变化者为阴性。

1.3 卵磷脂酶活性测定

参照文献[11]的方法进行，将被检菌点接于1%的卵黄琼脂平板上，于25℃培养5～7 d，若在菌落周围产生浑浊圈即为阳性，否则，为阴性。浑浊圈的大小和菌落出现的早晚可反应菌株卵磷脂酶的活性强弱。

1.4 牛奶凝固与胨化测定

参照文献[9]的方法进行，将牛奶10 000 r/min离心，去上层油脂成脱脂牛奶。将待测定菌株接种于脱脂牛奶中，25℃培养，分别在3 d、6 d、10 d、20 d和30 d各观察1次，若牛奶出现凝固即为凝固；若牛奶变得清亮而透明则为胨化。

1.5 生理生化试验

1.5.1 V-P 参照文献[13]的方法进行，将待测菌接种到配制好并灭菌过的葡萄糖蛋白胨培养液中，26℃培养7 d，根据培养液的多少适量先加入3 mLα-萘酚，再加入40%氢氧化钠溶液1.2 mL并充分振荡，以使空气中的氧融入，放在25℃恒温培养箱中保温25 min观察，若培养液呈红色，则为阳性反应，无色则为阴性反应，粉红色则为弱阳性反应。

1.5.2 甲基红 参照文献[13]的方法进行，将待测菌接种到葡萄糖蛋白胨培养液中，26℃培养7 d，后滴入甲基红试剂5～6滴，培养液立刻呈紫色的为阳性反应，呈黄色的阴性反应，橘黄色为弱阴性反应。

1.5.3 革兰氏染色 参照文献[13]的方法进行，涂片固定，草酸胺结晶紫染，水洗，番红染色液复染，干燥，镜检。阳性菌呈紫色，阴性菌呈红色。

1.5.4 明胶液化 参照文献[9]的方法进行，将被检菌穿刺接种于明胶培养基，深度约为2/3，于25℃培养7 d，逐日观察结果。在观察结果前，先置于4℃冰箱内30 min，再看结果，如培养基呈液化状态为阳性。

1.6 耐盐度及最适pH试验

1.6.1 耐盐度 配制200 mL不含NaCl的高氏一号培养基分装36支试管，每支5 mL，其中12支不含NaCl，12支NaCl浓度5%，12支NaCl浓度10%，灭菌后划线接种，25℃培养5～7 d观察菌株出现的早晚和生长情况来判断菌株的耐盐性。

1.6.2 最适pH 参照文献[14]的方法进行，配制500 mL高氏一号培养基，每取100 mL用广泛试纸调pH分别为7、8、9、10和11。将待测菌单划线分别接种到不同pH培养基，25℃培养5～7 d后观察菌株出现的早晚和生长情况，以判断菌株的耐碱性。

1.7 过氧化氢酶试验

用滴管滴1滴30%的过氧化氢于载玻片上，然后用接种环挑取少许菌株，将待测菌均匀涂在载玻片上，若出现气泡，则该菌有过氧化氢酶，否则，该菌没有过氧化氢酶。

1.8 数据处理

所有数据采用Excel 2003和SPSS17.0单因素ANOVA统计分析。

2 结果与分析

2.1 菌株的酶学特性及糖代谢方式

从表1可见，有8株菌株产脂肪酶，其中，SY1、MX1和细黄链霉菌的浑浊圈很明显，说明这3株菌株的脂肪酶活性较强，SY1脂肪酶水解圈直径最大，达22.00 mm；直径大于15 mm的菌株共计4株，占供试菌的33.3%。有10株菌株产生卵磷脂酶，其中，MX9卵磷脂水解圈直径最大，为(19.00±1.414) mm，直径大于15 mm的菌株共计5株，占供试菌株的41.6%。11株菌株对淀粉的水解力较强，其中，SY1淀粉水解圈直径最大，为(34.00±1.414) mm；直径大于15 mm的共计6株，占供试菌株的50%。供试菌酪蛋白水解能力较差，仅有4株菌株可水解酪蛋白，占所有供试菌株的33.3%，MX9酪蛋白水解圈直径最大，为(18.50±0.707) mm。

表1 不同菌株的水解能力

从表2可知，12株供试菌株革兰氏染色均呈阳性；V-P试验，MX1、MX2和SY1呈阳性，MX6呈弱阳性，说明这4株菌株的糖代谢是葡萄糖分解成丙酮酸，丙酮酸脱羧后成乙酰甲基甲醇。MX2、MX3和细黄链霉菌甲基红试验呈阳性，MX9呈弱阳性，说明这4株菌株的糖代谢是葡萄糖分解为丙酮酸，丙酮酸再分解为甲酸、乙酸和乳酸等。共有9株菌株可明胶液化，占供试菌株的75%，说明大部分菌株产明胶酶且酶活性较强。只有SY2菌株产纤维素酶，有3株菌株产过氧化氢酶。能使牛奶培养基凝固的菌株有2株，使其胨化的菌株有4株。

表2 不同菌株的酶学特性及糖代谢

注：+表示阳性反应；+-表示弱阳性；-表示阴性反应。

Note: +, positive reaction; +-, weakly positive; -, negative reaction.

2.2 菌株对pH和渗透压的适应性

通过试验观察，pH 7时，各菌株菌落生长的快慢依次为MX9>SY2>MX3>MX2>MX1>MX6>细黄链霉菌>MX8>SY1>MX5>MX7>MX4；pH 8时，各菌株菌落生长的快慢依次为MX7>MX1>MX9>细黄链霉菌>SY2>MX8>SY1>MX6>MX3>MX5>MX4>MX7；pH 9时，各菌株菌落生长的快慢依次为MX2>MX1>细黄链霉菌>SY1>MX9>SY2>MX8>MX4>MX6>MX3>MX7>MX5;pH10时，各菌株菌落生长的快慢依次为MX2>细黄链霉菌>MX1>SY1>MX8>SY2>MX3>MX9>MX5>MX7>MX6>MX4；pH 11时，各菌株菌落生长的快慢依次为SY1>MX1>MX2>SY2>MX9>MX6>细黄链霉菌>MX8>MX5>MX7>MX3>MX7。

从表3可知，在不同培养基培养5～7 d，12株菌株在NaCl溶液浓度为0～5%的培养基中长势均较好，说明12株菌株耐盐性较强。且在培养过程中MX7菌株生长速度最快，总是最先形成菌落，表明MX7菌株的耐碱性极强，但pH 11时，MX7长势最好。培养基的耐盐度为10%时，只有MX3和MX5菌株的长势较好，最适pH为9。

表3 菌株耐盐度及其最适pH值

Table 3 Salt tolerance and optimum pH value of different strains

菌株StrainsNaCl的耐受度/%Salttolerance0510最适pHOptimumpHvalueMX1++-11MX2++-7MX3+++9MX4++-7MX5+++9MX6++-7MX7++-11MX8++-7MX9++-7SY1++-11SY2++-7细黄链霉菌++-10 Streptomycesmicroflavus

注：+表示生长良好，-表示生长较差。

Note: +, good growth; -, poor growth.

3 结论与讨论

1) 研究结果表明，12株菌株的菌落光平且均为白色，基内菌丝颜色呈紫红色、柠檬黄和无色等，颜色不尽相同。参考《链霉菌鉴定手册》[15]得知，这11株生防放线菌菌株均属于链霉菌的白孢类群放线菌。试验中还发现，MX1和MX7均含脂肪酶、卵磷脂酶、淀粉酶和明胶酶；MX2均含卵磷脂酶和淀粉酶；MX3、MX9和细黄链霉素均含脂肪酶、卵磷脂酶、淀粉酶、酪蛋白酶和明胶酶；MX4和MX5均含卵磷脂酶、淀粉酶和明胶酶；MX6含淀粉酶和明胶酶；MX8含脂肪酶、卵磷脂酶和过氧化氢酶；SY1含脂肪酶、卵磷脂酶、淀粉酶、酪蛋白酶、明胶酶和过氧化氢酶；SY2含卵磷脂酶、淀粉酶、明胶酶、纤维素酶和过氧化氢酶。可见，从三叶草土壤中分离的SY1产酶最多，说明SY1菌株的代谢产物较多。11株生防放线菌菌株的形态特征和生理生化特征与细黄链霉菌不同。说明，从苜蓿和三叶草土壤中分离的11株生防放线菌可能是不同的白孢类群链霉菌。

2) 赵淑莉[16]从吉林省人参地、洮南和长白山自然保护区土样中筛选的BZ45菌株pH耐受范围是5.0～12.0，最佳的pH是7.0或8.0，明胶能液化，牛奶不但能凝固还能胨化，能产生脂肪酶，而淀粉不能水解，即无淀粉酶产生，有纤维素酶产生，能分解纤维素，耐盐范围为0.1%～5%。本研究从陕西省商洛市土样分离的11株生防放线菌菌株和细黄链霉菌均与BZ45菌株不同。本研究中12株供试菌株pH耐受范围均大于7.0，耐盐范围为0～5%。其中，有11株菌株可产生淀粉酶，8株菌株可产生脂肪酶，1株菌株可产生纤维素酶，2株菌株既能使牛奶凝固又能使其胨化，有9株菌株可使明胶液化。余佳清等[17]从江西井冈山自然保护区发病毛竹中分离到1株生防放线菌菌株FXj9，该菌株可使纤维素和淀粉水解，使明胶液化，使牛奶凝固不能使其胨化，能还原硝酸盐。本研究的12株供试菌株的生化反应与菌株FXj9不同。说明，不同生境条件及不同植被根际分布生防放线菌的特异性存在差异。

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(责任编辑： 杨 林)

Enzymatic Characteristics and Metabolites of Biocontrol Actinomycetes

LI Duishu

(CollegeofBiomedicineandFoodEngineering,ShangluoUniversity,Shangluo,Shaanxi726000,China)

The biophysical and biochemical test of 11 actinomycetes strains(MX1，MX2，MX3，MX4，MX5，MX6，MX7，MX8，MX9，SY1 and SY2)isolated from soil of Shangluo City in Shaanxi and testedStreptomycesmicroflavuswas conducted by the agar block and test-tube slant streak plate methods to obtain more biocontrol actinomycetes with different specificities. Results:The diameter of hydrolyzation circle of 4 strains from 8 strains with producing lipase is more than 15 mm, and SY1, MX1 andStreptomycesmicroflavusstrains have obvious hydrolyzation circles. The diameter of hydrolyzation circle of 5 strains from 10 strains with producing lecithinase is more than 15 mm. The diameter of hydrolyzation circle of 6 strains from 11 strains with strong starch hydrolysis capacity is more than 15 mm. 4 strains can hydrolyze casein. 12 tested strains present positive in gram stain test. MX1, MX2 and SY1 strains present positive and MX6 strain presents weakly positive in V-P test. MX2, MX3 andStreptomycesmicroflavusstrains present positive and MX9 strain presents weakly positive in methyl red test. 9 strains are of gelatin liquefaction capacity. Only SY2 strain can produce cellulose. 3 strains can produce catalase. 2 strains have the capacity of solidifying milk medium and 4 strains have the capacity of peptonizing milk.

biocontrol actinomycetes; enzymatic activity; glycometabolism; Shangluo; Shaanxi

2014-09-18； 2015-04-21修回

陕西省教育厅科学研究专项计划项目“生防放线菌诱导商洛黄芩抗根腐病及促生性研究”(2013JK0737)；商洛学院科研基金项目“生防放线菌多样性及其对黄芩根腐病防效研究”(13SKY-FWDF002)

李堆淑(1977-)，女，副教授，硕士，从事植物病理学及微生物学研究。E-mail:lds1202@163.com

1001-3601(2015)05-0258-0149-04

S154.38+3

A